Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

O sistema nervoso central contém uma subpopulação de células-tronco multipotentes, auto renovadora que têm a capacidade de dar origem a todas as células nervosas maduro diferentes tipos^1,2,3,4. Essas células-tronco neurais (NSCs) residem em nichos especializados do cérebro e da medula espinhal e pode ser ativadas após lesão para proliferar, migrar e se diferenciar em células maduras neurais. NSCs e seus descendentes foram mostrados para migrar para o local da lesão, em lesão cortical modelos^5,6. No cérebro, NSCs foram mostrados para migrar dos ventrículos laterais para o local da lesão, onde eles se diferenciar em astrócitos que contribuem para a formação de cicatriz glial⁷. Na medula espinhal, no entanto, poucos estudos foram feitos para perguntar se esses mesmos NSCs endógenos podem ser aproveitados para promover a recuperação após a lesão da medula espinhal. De fato, atualmente há um debate sobre se a ativação da pilha de haste piscina na medula espinhal exige um dano físico direto do nicho periventriculares revestem o canal central⁸ ou se os danos para a coluna vertebral cabo parênquima (deixando o tronco nicho de célula intacto) é suficiente para ativar endógena NSCs⁹.

Um número de modelos de lesão (SCI) da medula espinhal têm sido utilizado para estudar a fisiopatologia da lesão aguda e crônica. Estes modelos também tem sido usados para testar potenciais terapias para tratar SCI através de neuroproteção, imunomodulação e desenvolvimento celular transplante/substituição estratégias^10,11,13. Modelos atuais incluem compressão e/ou contusão lesões, que causam déficits funcionais em grande escala, bem como lesões extensas e cavitações no cabo^14,15. Cicatrizes gliais resultantes podem abranger diversos segmentos da coluna vertebral juntamente com a maioria de largura/circunferência do¹⁶da medula espinhal. Assim, enquanto estes modelos são clinicamente relevantes, arranjaram um desafio significativo para estudar a resposta de NSCs endógenas após lesão. Existem modelos de químicos da lesão que pode ser adaptado para causar formas mais leves de lesão que pode poupar o canal central¹⁷. No entanto, esses tipos de lesão focar a desmielinização associada com SCI e não são modelos clinicamente relevantes para o dano físico e/ou mecânico associado com Sci traumático.

Para lidar com as limitações dos modelos de lesão atual, nós adaptamos um agulha faixa mínima SCI modelo, originalmente desenvolvido no rato⁹, para a aplicação em um modelo do rato adulto. Nosso modelo de lesão adaptado pode criar uma lesão consistente na região dorsolateral da medula espinhal do mouse e poupar o canal central para o nível da lesão. A vantagem desse modelo é que ele permite o estudo da cinética de NSC após lesão e sua potencial migração radial para o local da lesão. O uso de um modelo de mouse também permite o uso de ratos transgénicos que permitem o monitoramento de linhagem de NSCs endógenos e seus descendentes após lesão. As propriedades do NSCs mais podem ser avaliadas usando uma forma modificada do ensaio em vitro neurosphere que é introduzida no presente protocolo.

O ensaio de neurosphere é um em vitro formadoras ensaio que permite o isolamento de NSCs na presença de mitógenos. Em densidades de chapeamento clonal, NSCs individuais proliferam para dar origem a colônias esféricas flutuantes de células que são compostas por uma pequena subpopulação de NSCs e uma grande maioria dos progenitores^18,19. Em nosso protocolo, demonstramos o isolamento de duas distintas, relacionadas a lineally NSCs da região periventricular da medula espinhal — sob condições de linha de base e seguir nosso modelo SCI mínimo. Definitiva neural da haste nestin expressa de células (dNSCs) e a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e são cultivados na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e heparina (juntos denominada EFH)²⁰. Estes dNSCs são raros na medula espinhal ingênuo, dando origem a muito poucas neurospheres em vitro. No entanto, mostramos que os dNSCs são ativados mínimo SCI, expandindo os números dos neurospheres isolada da região periventricular²¹a seguir. Células-tronco neurais primitivas (pNSCs) estão a montante do dNSCs na linhagem de células-tronco neurais. pNSCs são excessivamente raros, expressos níveis baixos do marcador pluripotência Oct4 e leucemia responsivo de fator inibitório (LiF)²². pNSCs não formam neurospheres quando isoladas de rato adulto medula espinhal devido à presença de proteína básica de mielina (MBP) em culturas primárias; no entanto, pNSC neurospheres pode ser isolado de ratos deficientes de MBP e seus números são lesões seguintes expandida — semelhantes a dNSCs²¹. Finalmente, mostramos que neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão em cedo vezes seguindo mínimo Sci. Estes resultados demonstram que o nosso modelo de lesão e ensaios podem avaliar as características de ativação de periventriculares NSCs tais como sua capacidade de proliferar e migrar em resposta a lesões.