应用 ImageJ 对免疫组化制备组织显微照片小胶质细胞形态学的定量研究

所有实验均根据亚利桑那大学动物保育和使用委员会制定的指导方针和美国国立卫生研究院关于护理和使用实验动物的指导方针予以批准和执行。注意尽量减少动物的疼痛和不适。安乐死的方法是根据批准的协议, 包括宫颈斩首在异氟醚麻醉下。 1. 组织准备 注意: 对固定的 cryoprotected 组织标本进行小胶质细胞形态学分析, 以保留细胞膜形态学。以下为荧光 IHC 制备和直接切片固定组织的标准协议。 在所需实验后, 根据标准实验室协议, 从安乐死动物中取出老鼠或老鼠的大脑。将大脑放入一个10毫升的小瓶中, 其中含有5毫升4% 多聚甲醛溶液, 24 小时4摄氏度。然后冲洗并放入5-10 毫升的30% 蔗糖磷酸盐缓冲溶液 (PBS, 0.01 米) 为72小时在4摄氏度。存储整个大脑在-80 °c, 直到组织切片与恒温器, 或在4摄氏度, 如果切片与切片。注意: 本协议尚未使用石蜡嵌入组织切片进行测试。 用恒温器或切片在抗冻溶液中 (50 毫米 PBS、乙二醇、甘油) 在-20 摄氏度处储存自由浮动部分, 将脑组织按所需断面厚度和方向进行切片。注意: 该协议已成功地进行了冠状组织切片范围从50µm 到200µm 的厚度。少于50µm 的组织切片可能无法捕获小胶质细胞过程的全跨度, 而在厚的组织切片中, 由于抗体渗入组织, IHC 染色可能不完善。组织可以切片, 无论是在冠状或矢状方向, 这一选择将取决于实验目标和大脑区域 (s) 的研究。 2. 免疫组化 注: 骨架和分形分析方法可应用于荧光或 3,3′-diaminobenzidine (IHC)。以下是标准荧光 IHC 协议, 可根据需要替换。与 IHC 相比, 荧光 IHC 产生了细胞过程的卓越可视化。 将组织切片放入4毫升玻璃瓶 (最多15只老鼠脑切片/小瓶), 并孵育1毫升溶液, 含多达10% 匹马血清, PBS (0.01 米), 0.5% 海卫, 0.04% 南3在室温 (23 °c) 为 1 h。 室温下用 PBS (0.01 米) 清洗5分钟。 用主抗体 (Iba1, 1:1, 000) 在室温下孵育72小时, 含 PBS (0.01 米), 0.5% 海卫, 0.04% 南3, 并覆盖 (以保留 NaN3有效性)。 室温下用 PBS (0.01 米) 清洗5分钟。 孵育与二级抗体 (抗兔 488, 1:250) 在室温下覆盖4小时1毫升的解决方案, 包括 PBS (0.01 米), 0.5% 海卫, 0.04% 南3 室温下用 PBS (0.01 米) 清洗5分钟。 将脑组织部分 (基于首选项的数量和方向) 安装到地基幻灯片上, 将软集安装介质应用于幻灯片, 并将盖玻片放在组织上。将幻灯片存储在摄氏4摄氏度。注: 共焦成像需要1.5 玻璃盖玻片厚度。软集是首选的安装介质, 因为高粘度不压缩组织, 最好保留的形态与硬集安装介质相比。 3. 成像 图像 Iba1 脑组织部分阳性细胞使用一个明亮的领域或共聚焦显微镜, 具有 z 堆栈获取能力使用20X 目标或更大。注: 实验中所有显微照片的成像参数和软件设置应该是恒定的。使用40X 或63X 目标获得优秀的工艺细节。可以将本文描述的骨架分析协议应用于一个较大的显微照片中的整个显微照片或多单元 ROI。 使用特定于显微镜软件的适当软件设置获取8位图像。注意: 将文件转换为8位后获取可能会扭曲数据收集。 使用特定于显微镜软件的适当软件设置, 获取至少30µm z 堆栈, 其图像之间不超过2µm 间隔。注: 显微镜和软件应允许在 X、Y 和 Z 轴上进行图像采集。z 栈可以增加, 时间间隔可以减少, 以提供额外的小胶质细胞细节。作为交换, 成像时间会增加。在可能的荧光显微镜下使用采样取样。 将所有文件保存为 Tif 文件或显微镜软件的要求。 在 ImageJ 中打开 Tif 文件, 然后使用工具栏通过单击图像 |颜色 |拆分通道, 并通过单击图像来堆叠图像|栈 |X 项目 |最大强度投影酌情。另存为. tif 文件。 4. 骨架分析 从 下载斐济或 ImageJ。对于单个插件, 从 15下载 AnalyzeSkeleton (2 维/3 d), 然后从 16下载 FracLac。注意: 将显微照片转换为二进制骷髅图像的整个过程需要少于1分钟。 如果使用荧光显微照片, 请确保图像为8位, 并转换为灰度, 以最佳的可视化所有正染色。使用工具栏并单击图像 |查阅表格 |灰色。如果使用民建联的明亮现场照片, 首先使用 FFT 带通滤波器插件 (使用工具栏单击进程 |FFT |带通滤波器), 然后转换为灰度。注意: 为了本协议的目的, ImageJ 的 FFT 带通滤波器的默认设置是足够的 (最多可筛选3个像素, 降低到40个, 不带条纹抑制)。应用 FFT 带通滤波器消除噪音 (小功能), 同时保持图像的整体较大的方面。这在明亮的场图像中尤其有用, 因为在这种情况下, 组织中的分裂和裂纹可以作为背景出现, 从而使骨架分析18复杂化。 调整亮度和对比度, 如果图像太暗, 小胶质细胞过程无法可视化。使用工具栏并单击图像 |调整 |亮度/对比度。根据需要调整最小或最大滑块, 直至直方图的边缘, 但不进一步。注意: 在 ImageJ 中, 通过更新图像的查阅表格 (查找表) 来更改亮度和对比度, 因此像素值不变。最大和最小滑块控制显示范围的下限和上限, 像素值在255以上出现白色和像素值, 低于0出现黑色18。在荧光显微照片的情况下, 应使用最大滑块, 而最小滑块将用于显微照片染色小胶质细胞。 通过单击 “进程 |”, 运行 Unsharp 掩码筛选器以进一步提高对比度. 过滤器 |Unsharp 掩码。为了本协议的目的, 使用 ImageJ 的默认设置 (像素半径为3和掩码重量为 0.6)。注意: Unsharp 掩码通过从原始图像中减去图像 (Unsharp 掩码) 的模糊版本来锐化和增强图像的边缘特征, 然后将生成的图像与原始映像的高对比度版本合并。因此, Unsharp 掩码筛选器不会创建详细信息, 而是澄清图像中的现有详细信息。radius 设置会更改 Unsharp 掩码的模糊程度 (以及将删除多少模糊), 而掩码权重设置会更改 Unsharp 掩码将与之合并的对比度 (从而调整最终图像的对比度)。 执行去斑步骤以清除 Unsharp 掩码生成的椒盐噪音。使用工具栏并单击进程 |噪声 |去斑。注: 去斑在 3 x 3 邻域中用中值替换每个像素, 消除了椒盐噪声。其效果是, 强度中的异常值被中间像素替换, 而不影响边缘的锐度18。 使用工具栏将图像转换为二进制文件, 方法是单击图像 |调整 |阈值。注意: 阈值 stratifies 将灰度图像转换为兴趣与背景的特征, 并将图像转换为二进制18。 应用去斑、关闭和移除异常函数: 在生成的二进制图像中, 可能存在单像素背景噪声和进程之间的间隙。 通过单击 “进程 |”, 使用工具栏应用去斑函数噪声 |去斑。注意: 将去斑应用于二进制图像将删除任何剩余的单像素噪声。 通过单击 “进程 |二进制 |关闭。注: 此插件连接两个暗像素, 如果它们被分离最多2像素。 通过单击 “进程 |噪声 |删除异常点。注意: 为了本协议的目的, 明亮的异常点的目标是像素半径为 2, 阈值为50。如果它偏离了超过某个值 (阈值)18, 则该插件会在周围区域中的中点像素处替换明亮或暗的异常像素。 将图像另存为单独的文件, 以供将来使用和/或分形分析, 并通过单击 “处理” (缩略) 工具栏来对图像进行使用. 二进制 |缩略。 使用工具栏选择骷髅图像并运行插件 AnalyzeSkeleton (2 维/3 d), 方法是单击插件 |骨架 |分析骨架, 并检查分支信息框。注意: 图像处理很可能需要通过添加或删除上述建议的步骤来优化。在这个过程中, 通过创建骨架和原始图像的叠加来评估骷髅图像的准确性。Somas 应该是单一的起源点与进程产生的中心;循环 somas 混淆数据, 应通过协议调整来避免。图 1中说明了单个原点与圆形 somas 的示例。 常见的问题导致非代表性的骨骼和建议的解决方案: 图像太暗: 转换为灰度, 调整亮度/对比度滑块, 并/或应用 Unsharp 掩码 背景太多: 调整亮度/对比度滑块, 应用去斑和/或删除异常点 骷髅图像中的圆形 somas (特别是荧光图像): 应用 FFT 带通滤波器和/或 Unsharp 掩码 组织中的裂纹 (特别是明亮场图像): 应用 FFT 带通滤波器和/或去斑 复制结果中的所有数据并分支信息输出, 并将数据粘贴到 Excel 电子表格中。 在 Excel 中, 修剪数据以删除 IHC 和图像获取所产生的骨架碎片。 将实验工作簿与骨架分析中的原始数据输出复制, 并将修剪添加到文件名中。所有后续的数据修整都应出现在重复的工作簿中, 以保留原始数据以供将来使用和引用。 通过在 ImageJ 中打开骷髅图像并选择 “线条” 工具, 确定将从数据集中裁剪的片段长度。测量几个片段, 记下平均长度, 并决定一个截止值。注: 对于此处提供的数据, 不想要的碎片的截止长度为0.5。此值应在整个数据集中保持一致。 自定义对 Excel 电子表格进行排序, 单击排序 & 筛选 |自定义排序。按 “端点素” 排序, 从最大到最小, 在一个新的层次, 由 “Mx 分支 pt” 从最大到最小。 删除包含2个端点的每行, 其最大分支长度小于截止值(i. e, 0.5)。求和 “端点” 列中的数据, 以计算从图像中收集的终结点的总数。 对分支信息数据重复: 按 “分支长度” 从最大到最小排序。滚动数据并删除每行的分支长度小于截止值(i. e, 0.5)。求和 “分支长度” 列中的值, 以计算从图像收集的所有分支的汇总长度。 对每个图像/工作表重复步骤 4.11.3-4.11.5, 直到所有数据都已修剪和汇总为止。 用相应图像中的小胶质 somas 的数量除以每个图像的数据 (端点数和汇总分支长度)。在统计软件中输入最终数据 (端点/单元格 & 分支长度/单元格)。注: 汇总的分支长度/单元格数据可能需要从长度 (以像素为单位) 转换为微米。 5. 分形分析 注意: FracLac 可以运行许多不同的形状分析, 这是不包括在本协议中。有关 FracLac 的各种功能的详细说明, 请参阅 和相关引用的 FracLac 手册2,16,19。分形分析利用上面描述的 4.1-4.7 协议步骤。 确定将用于所有分形分析的 ROI 的大小。使用矩形工具绘制 ROI。确保该框足够大, 足以捕获整个单元格, 并且可以在整个数据集中保持一致。注意: 使用矩形选择而不是手绘选择, 以确保所有 ROIs 都是相同大小的矩形, 因此, 单元格具有相同的刻度。如果使用徒手选择, 则不会出现这种情况, 因为 ImageJ 将自动缩放平方 ROI 以适应不同大小的矩形窗口, 从而产生不同比例的单元格。当分形形状与尺度无关时, 使用 FracLac 对 ImageJ 的分形分析过程依赖于尺度16。因此, 在整个数据收集过程中, 需要有一个一致的大小 ROI。 随机选择小胶质细胞进行分形分析, 在每个显微照片和相应的二进制图像。在 roi 管理器窗口中, 选择Update将 ROI 锁定到单元格的位置。使用ctrl+ Shift + D将 ROI 中的区域复制为新窗口, 然后保存裁剪的单元格。在相应的二进制图像 (从骨架分析) 中, 使用 ROI 管理器复制同一单元格区域。重复直到为分形分析随机选择足够数量的单元格, 并保存所有文件。注: 随机数发生器和编号网格可用于随机选择单元格。 使用单个单元格打开二进制图像。双击 “画笔” 工具, 将颜色设置为黑色, 并根据需要调整画笔宽度。使用匹配的显微照片作为参考, 使用画笔删除相邻的单元进程, 连接零碎的进程, 并隔离感兴趣的单元格。二进制单元格被隔离后, 保存二进制文件。注意: 按住 “alt” 将画笔从前景色 (黑色) 切换到背景色 (白色)。 使用工具栏通过 “进程 |” 将二进制单元格转换为轮廓二进制 |大纲。注意: 图像 J 的 FracLac 可以在实体形状或形状轮廓上使用, 但是, 当前的约定是使用形状轮廓16。 在工具栏中, 使用工具栏打开 FracLac, 方法是单击插件 |分形分析 |FracLac并选择BC (方框计数)。在网格设计设置中, 将Num G设置为4。在图形选项下, 选中度量值框以分析单元的凸壳和边界圆。完成后, 选择确定。注: num g 是扫描期间使用的方框计数网格方向数, 并且建议的 num g 的范围为4-12。在 FracLac 手册16中全面审查了 Num G 设置和建议的范围。增加数 G 可以大大减慢计算时间。FracLac 设置将只需要设置一次每会话。输入设置后, 扫描按钮将变为可用。 选择扫描按钮以对所选图像运行一个方框计数扫描。注: 扫描将生成三个具有数据输出的窗口: 船体和圆形结果、方框计数摘要文件和扫描类型。”扫描类型” 窗口包含所用设置的日志, 以及某些度量值的标准偏差。为了本协议的目的, 不使用 “扫描类型” 窗口, 可能会关闭或保存以供将来参考。 在赫尔和循环结果窗口中, 复制所有所需的数据 (i. e, 密度, 跨度比和圆形) 结果。在”框计数摘要” 窗口中, 复制所需的数据 (i. e, 分形维度和 lacunarity) 结果。将复制的数据传输到 Excel 文件或统计软件。注意: 在 ImageJ 手动16的 FracLac 中提供并彻底解释了 FracLac 输出数据的完整列表。