التصور لرواسب بيتا اميلويد في الدماغ البشري مع الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين التصوير الكتلي
Summary
يسمح التصوير الجزيئي مع الليزر ساعد مصفوفة على الامتزاز/التأين التصوير الطيف الكتلي (استخدام نظام الرصد الدولي) تعيين تحليلها متعددة متزامنة في العينات البيولوجية. نقدم هنا، بروتوكولا للكشف والتصور لبروتين بيتا اميلويد في أنسجة الدماغ من مرض الزهايمر وعينات أنجيوباثي اميلويد الدماغي استخدام استخدام نظام الرصد الدولي.
Abstract
أمراض الأعصاب مرض الزهايمر (AD) تتسم بالتراكم والتجميع من الببتيدات اميلويد بيتا (Aβ) إلى خارج الخلية لويحات الدماغ. الببتيدات Aβ، مؤلفة من 40 من الأحماض الأمينية، تتولد من بروتينات اميلويد السلائف (التطبيق) من سيكريتاسيس β و γ. وتودع Aβ ليس فقط في حمة الدماغي ولكن أيضا في ليبتومينينجيل وجدران الأوعية الدماغية، المعروف باسم أنجيوباثي اميلويد الدماغي (هيئة الطيران المدني). وبينما تم تحديد مجموعة متنوعة من الببتيدات Aβ، مفصلة إنتاج وتوزيع من الببتيدات Aβ الفردية في الأنسجة المرضية للإعلان والجهاز المركزي للمحاسبات لم تعالج تماما. هنا، علينا وضع بروتوكول لليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين-تعتمد التصوير الكتلي (استخدام نظام الرصد الدولي) في أنسجة المخ البشري تشريح الجثة للحصول على رسم خرائط شاملة البروتين. ولهذا الغرض، تم الحصول على العينات القشرية البشرية من البنك الدماغ في “معهد طوكيو متروبوليتان لعلم الشيخوخة”. كريوسيكشنز المجمدة هي قطع ونقلها إلى الإنديوم-تين-أكسيد (إيتو)-المغلفة الشرائح الزجاجية. أطياف يتم الحصول عليها باستخدام نظام استخدام بدقة مكانية تصل إلى 20 ميكرومتر. حمض سينابينيك (SA) هو شكل موحد المودعة على الشريحة باستخدام بخاخ يدوي أو تلقائي. مع مزايا التقنية الحالية لاستخدام نظام الرصد الدولي، يمكن الحصول على مجموعة بيانات نموذجية من مختلف الأنواع Aβ داخل نفس المقاطع للعقول البشرية تشريحها دون تحقيقات محددة. وعلاوة على ذلك، عالية الدقة (20 ميكرومتر) تصوير الدماغ الإعلانية والالتهاب الجهاز المركزي للمحاسبات نموذج يبين بوضوح أن Aβ1-36 إلى Aβ1 41 ترسبت في سفن ليبتومينينجيل، بينما Aβ1-42 و Aβ1 43 أودعت في حمة الدماغي كلوحة خرف (SP). أنه من الممكن اعتماد استخدام نظام الرصد الدولي باعتباره نهجاً موحدا في تركيبة مع الملاحظات الإكلينيكية والوراثية والمرضية في فهم علم الأمراض الإعلانية، والجهاز المركزي للمحاسبات، وغيرها من الأمراض العصبية استناداً إلى الاستراتيجية الحالية.
Introduction
لإجراء التشخيص وفهم الآلية المرضية لاضطرابات الأعصاب، هو تحديد دقة الجزيئية للرواسب المرضية الأساسية1. أثناء الإعلان، Aβ يتم إنتاجه لجعل الصحة والصحة النباتية في حمة الدماغي والمودعة في سفن قبل وقت طويل من المرض بداية2،3،4،،من56. بينما Aβ1-42 هو الببتيد الغالبة في SP للعقول الإعلانية، متغيرات Aβ الأخرى، مثل الطرفي ن أو ج-محطة اقتطاع أو تعديل Aβs، كما حددت في المتضررة الإعلانية العقول7،،من89، 10. صورة كاملة الأنواع طائفة واسعة من Aβ في العقول البشرية، لا سيما مع إعلان والدماغي سوف تساعد أنجيوباثي اميلويد (الجهاز المركزي للمحاسبات)11، العلماء على فهم إنتاج Aβ والايض، وترسب.
وقد إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) كالنهج التقليدي لأمراض الأعصاب، الأسلوب الأكثر حاسمة لتحديد موقع Aβs في الدماغ الأنسجة12،13،،من1415. وبصفة عامة، لا يميز المدينة الجزيئات عندما [ابيتوبس] عدة تتعايش في نفس الوقت. على النقيض من ذلك، يتم تحليل البروتين البشري الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي ناشئة نهجاً قيمة خاصة بالنسبة لتحليل مجموعة متنوعة من أنواع Aβ في أنسجة المخ، الذي لا يمكن أن تكون متباينة مع الأجسام المضادة16،17. فشل الكشف طفيفة Aβ الببتيدات التحليل الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي التقليدي ليساتيس الدماغ وعينات عجلت المناعية ويفقد توزيع المعلومات Aβ في أنسجة المخ.
في أعمال سابقة، تصور رواسب Aβ في أدمغة الفأر قد نجح باستخدام نموذج حيوانات المحورة وراثيا من الإعلان، مثل APP23. ومع ذلك، تحتاج هذه العملية لا يزال التقدم التقني لمقارنة نظام الرصد الدولي والمدينة فيما يتعلق بالقرار وحساسية18،،من1920. ينبغي دراسة أمراض الأعصاب الإعلانية على العقول البشرية، واستخدمنا تكنولوجيا استخدام نظام الرصد الدولي على أنسجة المخ البشري تشريح الجثة للحصول على رسم خرائط شاملة البروتين21. ولهذا الغرض، قمنا بتطوير بروتوكول لنوع متقدم من الطيف الكتلي له مزايا في سرعة وحساسية، وإمكانية تكرار نتائج.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا أظهرنا بروتوكول مفصل ونتائج التصور Aβ وما إيسوفورمس من العقول أوتوبسيد عدة مع الإعلان والجهاز المركزي للمحاسبات مع استخدام نظام الرصد الدولي. تم تغيير صورة Aβs ترسب جذريا من Aβ1-42 إلى الاختلافات الطرفي ن وج. Aβ1-41 للمرة الأولى تحديد وتصور في العقول البشرية مع البروتوكول الحالي وكذلك التحقق من صحة مع المدينة21. إذ ترى أن مورفولوجية Aβ المودعة بنظام الرصد الدولي بتحليل الاستبانة (20 ميكرومتر) يجب أن يكون في اتفاق جيد مع المدينة، نظام الرصد الدولي والمدينة على قدم المساواة تسهم في التمييز بين رواسب Aβ بمواقعها ومحتويات البروتين، وكذلك على مورفولوجيا. كما أجرى التجربة كامل الموصوفة هنا في قشرة والقفويه، سوف المعمم دراسة التعريب من مختلف الأنواع اميلويد بيتا في جميع المناطق الدماغ مع تجارب المستقبل باستخدام البروتوكول الحالي.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول خطوات إعداد الأنسجة للحصول على تاين فعالة من البروتينات مجمعة في أنسجة الدماغ البشري. مطلوب طبقة مصفوفة لامتصاص طاقة الليزر والحث على الامتزاز والتاين لتحليلها. في هذه العملية، هو البلوتينيوم المغلفة قسم أنسجة كاملة مع بلورات صغيرة. كوكريستاليزيشن متجانسة من أكثر مع المصفوفة حاسم بالنسبة للتصوير بحساسية عالية وخالية من القطع الأثرية. كل من الطرق الثلاث رذاذ مزاياه الخاصة. طلاء الرش اليدوي إحدى الطرق الأكثر استخداماً. بخاخة مناسب؛ ومع ذلك، فإنه يتطلب عملية ماهراً. كما ضروري تقنية تجريبية دقيقة واستنساخه، يوصي باستخدام بخاخ الموجات فوق الصوتية و/أو بخاخ تلقائي كما هو موضح في البروتوكولات الحالية. فيما يتعلق ببخاخ الموجات فوق الصوتية، لن تتأثر بالرطوبة ودرجة حرارة الغرفة نظراً لأنه يتم رش في دائرة. وفي الوقت نفسه، مع بخاخ تلقائي، يتم الحصول على القرار المكانية نسبيا المحفوظة مع إمكانية تكرار نتائج جيدة. عموما، أن القرار المكانية التي تم الحصول عليها مع زيادة ثلاثة أساليب ترتيب 1) البخاخة، وجهاز 2) التلقائية وبخاخ 3) الموجات فوق الصوتية.
الأهم من ذلك، هذا البروتوكول تم إنشاؤها أصلاً لكشف وتصور Aβs في عينات المخ البشري تشريحها. في وقت سابق ذكرت تصور Aβs مع استخدام نظام الرصد الدولي للفئران APP23، التي يتم إنشاؤها كنموذج حيوان من الإعلانات استناداً إلى الطفرة السويدية-نوع من التطبيق البشرية، قبل الآخرين مع القائمة18،أسلوب19. ومع ذلك، البروتوكول السابق ينطبق على APP23 لم تكن كافية لتصور Aβ في قرارها الأفقي وحساسية. وناقش الأشغال السابقة أن تركيزات عالية Aβ خارج حدود الأنسجة هي وضوح التحف في APP23 التصوير مع18،البروتوكول على19. وهذا يعني أن ما يسمى ‘الضبابية’ بين الصحة والصحة النباتية حقيقية ونظام الرصد الدولي الصور بسبب الخطوة استخراج مصفوفة أمر لا مفر منه مع استخدام نوع التصوير. ومع ذلك، في البروتوكول الحالي، اختفى طمس وتمثل كل الطيف كل ليرة سورية واحدة في حمة الدماغ.
كما هو موضح هنا، يمكننا تتبع Aβ1-41 للمرة الأولى في الإعلان والجهاز المركزي للمحاسبات العقول مع استخدام نظام الرصد الدولي، وكذلك مع المدينة، مع جسم معين بمنطقتنا جيل21. وفقا لنموذج تجهيز Aβ، Aβ1-38 مستمد من Aβ1-45 عن طريق Aβ1-42، في حين Aβ1-41 مستمد من Aβ1-45 γ-سيكريتاسي الانقسام التدرجي27،،من2829،30،31 . وهذا يعني أن البروتوكول الحالي يدعم هذا الطراز. أما بالنسبة للقيود المفروضة من هذا الأسلوب، يجب أن ننظر إلى عدم تجانس العينات المأخوذة من الدماغ البشري تشريح الجثة. أن الخطوة الأكثر أهمية، بمعنى من المعاني، تقييم أنسجة المخ التشريح المؤهلين مع إثبات الأخلاقية. مع البروتوكول الحالي على أنسجة الدماغ تلك الجثة المؤهلين، يمكن استخدام نظام الرصد الدولي منفردة تتبع توزيع كله من جزيئات معقدة بعد عدة تعديلات، فضلا عن factor(s) غير معروف تنظيم الآلية المرضية للإعلان، التي لا يزال يتعين تعريف. وعلاوة على ذلك، في فهم الآلية المرضية الشاملة لمختلف أمراض الأعصاب في العقول البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين، يجب أن يكون ممكناً اعتماد استخدام نظام الرصد الدولي باعتباره نهجاً موحدا، بالاقتران مع الملاحظات الإكلينيكية والوراثية والمرضية في الأمراض العصبية .
خطوة حاسمة أخرى من استخدام نظام الرصد الدولي هو عملية استخراج البيانات من مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها، ودائما مضيعة للوقت. ويتطلب التعدين البيانات يدوياً لكل توزيع الذروة للمستخدمين النقر فوق كل صورة وابحث عن التوزيعات التي قد ترتبط بالتشكل العينة التي تم تحليلها. يمكن استخدام التجزئة التلقائية المكانية كخطوة أولى للبيانات التعدين، وتقديم لمحة عامة عن مجموعة البيانات وتسمح الكشف السريع عن السمات البارزة. في هذا النهج، إحصائيا تحدد أوجه التشابه بين أطياف منطقة بعينها، وأطياف مماثلة يتم تجميعها في مجموعة واحدة. كل بكسل يتم ترميز وفقا لانتدابهم الكتلة (الشكل 5). في هذه الدراسة AD/الجهاز المركزي للمحاسبات، هو مجال اهتمام فضاء ترسبات Aβ في اللوحة متني وهياكل الأوعية الدموية تحت العنكبوتية ومتني. وكانت قمم مميزة اثنين وكذلك التحقق من صحة مع المدينة قيم m/z من Aβ1-40 و Aβ1 4221. وهكذا، فمن السهل العثور على كولوكاليزيد m/z مع Aβ1-40 و 42 Aβ1 التي تم بالفعل Aβ مبتوراً المشروح للطرفي ن وجيم، فضلا عن الببتيدات غير معروف، لمزيد من التحليل.
وأفاد ويلر والزملاء أن Aβ تتراكم في جدران الأوعية، أكثر حول الشرايين مما حول الأوردة21. وعلاوة على ذلك، فقد اقترح أن يشمل السائل الخلالي (قوي الأمن الداخلي) Aβs تفرز من حمة الدماغي للعقدة الليمفاوية عن طريق ارتشاح صرف مسار22،،من2324،25 ،26. ويدعم البروتوكول الحالي لإنشاء مخطط تجزئة استناداً إلى مجموعة بيانات استخدام نظام الرصد الدولي بدقة 20 ميكرومتر احتمال وجود مسارات الصرف ارتشاح في المخ (الشكل 5)، التي تسهم إسهاما كبيرا في الجهاز المركزي للمحاسبات في الإعلان21 , 32-وعلاوة على ذلك، يمكننا اكتشاف البروتينات علامة كولوكاليزيد مع اللوحة والمفرج تحت العنكبوتية عن طريق حساب الارتباط لكل قيم m/z. في فهم الآلية المرضية الشاملة لمختلف أمراض الأعصاب في العقول البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين، يجب أن يكون ممكناً اعتماد استخدام نظام الرصد الدولي كنهج قوية في تركيبة مع المنشأة المدينة البيانات السريرية، والوراثية، والملاحظات المرضية في الجهاز العصبي الأمراض.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جزئيا معونات “البحث العلمي” في “مجالات مبتكرة” (بروتين الدماغ الشيخوخة والخرف التحكم 26117004؛ لمي والخرائط). جزئيا أيده هذا البحث “برنامج البحوث الاستراتيجية” “علوم الدماغ” من وكالة اليابان “البحوث الطبية” والتنمية (AMED). أجريت جميع التجارب امتثالا للمبادئ التوجيهية سيصلون.
Materials
| Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
| Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
| O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
| Scanner | EPSON | GT-980 | |
| Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
| Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
| Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
| Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
| Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
| Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
| MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
| Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
| Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
| Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
| Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
| Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |
Referências
- Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189 (2016).
- Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).
- Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
- Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer’s disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
- Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
- Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer’s disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24 (2016).
- Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
- Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer’s disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
- Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
- Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer’s disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
- Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
- Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
- Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
- Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer’s Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
- Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
- Stoeckli, M., et al. MALDI MS imaging of amyloid. Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
- Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73 (2017).
- Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
- Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer’s disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
- Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
- Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
- Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
- Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
- Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
- Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
- Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
- Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
- Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).
