Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Regolazione dell’espressione genica in cellule è controllata da meccanismi trascrizionali, post-trascrizionale e post-traduzionali. Progressi nel sequenziamento di RNA profondo consentono lo studio dei livelli di mRNA di stazionario su scala genomica a un livello senza precedenti. Tuttavia, recenti scoperte hanno rivelato che il livello di mRNA allo steady-state non correla sempre con proteina produzione^1,2. Il destino di una trascrizione individuale è molto complesso e dipende da molti fattori come stress, stimoli interni/esterni, ecc. Regolazione dell’espressione genica durante la sintesi delle proteine fornisce un ulteriore livello di controllo necessario per una risposta rapida in condizioni di cambiamento di espressione. Profili, la separazione e la visualizzazione di tradurre attivamente ribosomi, polisoma (o “polyribosome”) è un metodo efficace per studiare la regolazione della sintesi proteica. Anche se le prime applicazioni sperimentali è apparso in the 1960s³, polisoma profilatura è attualmente una delle tecniche più importanti nella proteina traduzione studi⁴. Singolo mRNA può essere tradotto da più di un ribosoma che portano alla formazione di un polisoma. Le trascrizioni possono essere bloccate sui ribosomi con cicloesimmide⁵ e mRNA contenente diversi numeri di polisomi possa essere separati nel processo di frazionamento polisoma da saccarosio ultracentrifugazione di pendenza^{6,7 , 8 , 9}. analisi di RNA delle frazioni polisomici quindi permette la misura dei cambiamenti negli Stati traduzionali di singoli mRNA su scala genomica e durante diverse condizioni fisiologiche^{4,7, 10}. il metodo è stato utilizzato anche per rivelare i ruoli di 5′ UTR e 3′ UTR sequenze nel controllo di mRNA traducibilit๹, esaminare il ruolo dei miRNA nella repressione traduzionale¹², difetti nella biogenesi dei ribosomi¹³ e comprendere il ruolo delle proteine associate ribosoma con malattie umane^14,15. Durante l’ultimo decennio, un ruolo sempre più importante per la regolazione dell’espressione genica durante la traduzione è emerso che illustra la sua importanza nelle malattie umane. La prova per controllo traduzionale in cancro, metabolico e malattie neurodegenerative è schiacciante^15,16,17,18. Ad esempio, disregolazione del controllo traduzionale eIF4E-dipendente contribuisce all’autismo relativi deficit¹⁵ e FMRP è coinvolto in stallo dei ribosomi su mRNA legati all’autismo¹⁴. Così, profili polisomici è uno strumento molto importante per studiare i difetti nella regolazione traduzionale in malattie umane multiple.

Analisi della proteina di polisomici frazioni in differenti condizioni fisiologiche analizza la funzione dei fattori connessi con i ribosomi durante la traduzione. La tecnica di profilatura polisoma è stata utilizzata in molte specie tra cui il lievito, le cellule di mammiferi, piante e protozoi^10,19,20,21. Protozoi parassiti come Trypanosoma e Leishmania esibiscono limitato controllo trascrizionale dell’espressione genica. Loro genomi sono organizzati in cluster di geni coregolati polycistronic che la mancanza di trascrizione promotore-regolato²². Invece, espressione genica inerente allo sviluppo è controllato principalmente al livello della proteina traduzione e stabilità del mRNA in Trypanosomatidae specie^23,24. Di conseguenza, la comprensione del controllo traduzionale in assenza di regolazione trascrizionale è particolarmente importante per questi organismi. Profilatura polisomici è un potente strumento per studiare la regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica in Leishmania^25,26,27,28.

I recenti progressi nella rilevazione dei livelli di singoli mRNA dal real tempo quantitative PCR (RT-qPCR) e completo trascrittoma di sequenziamento di nuova generazione, nonché tecnologie di proteomica, offre una risoluzione e vantaggi di profilatura polisomici ad un nuovo livello. L’uso di questi metodi può essere ulteriormente esteso dall’analisi delle singole frazioni polisomici di sequenziamento di RNA profondo combinato con analisi proteomica per monitorare lo stato traduzionale delle cellule su una scala di genoma. Ciò permette l’individuazione di nuovi giocatori molecolari che regolano la traduzione sotto differenti condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo un polisoma universale protocollo utilizzato su tre diversi modelli di analisi: il parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Vi presentiamo consigli sulla preparazione dei lisati cellulari da organismi differenti, ottimizzazione delle condizioni di gradiente, scelta di inibitori della RNAsi e applicazione di RT-qPCR, Western blot ed elettroforesi del RNA per analizzare le frazioni polisoma in questo studio.