Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

(1) mikrofluidischen Gerät Fertigung Vorbereiten der mikrofluidischen Maske Designs mit Computer aided Design (CAD) Software (als vorgesehen. DWG; siehe Zusätzliche Dateien). Haben Sie diese Entwürfe durch den Verkäufer mit einer 10 µm Auflösung auf einer Leiterplatte Folie gedruckt.Hinweis: Für mehrschichtige mikrofluidischen Geräte enthalten die entsprechenden Masken Ausrichtungsmarken. Für jedes Gerät den SU-8 master-Form (Abbildung 1A) wie folgt zu fabrizieren. Bereiten Sie einen 3 – In-Durchmesser-Silizium-Wafer durch Gießen etwa 1 mL der SU-8 3025 Photoresist auf die Mitte des Wafers. Sichern der Wafer auf der Spin Coater Futter durch die Anwendung der sog. Siehe Tabelle 1 für eine Auflistung der Schichtdicken und Geschwindigkeiten für jedes Gerät zu drehen. Für alle Geräte, beginnen die Spin-Beschichtung mit 30 s bei 500 u/min, gefolgt von 30 s mit der angegebenen Geschwindigkeit. Entfernen Sie die SU-8-Silizium-Wafer aus Spin Coater und weiche Backen auf einer Herdplatte setzen auf 135 ° C für 30 min. kann den Wafer nach dem Backen auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die SU-8-Silizium-Wafer mit der entsprechenden mikrofluidischen Maske unter einem kollimierten 190 mW, 365 nm UV-LED 3 Minuten lang aussetzen. Backen Sie nach der Belichtung hart die Wafer auf eine Herdplatte auf 135 ° C für 1 min festgelegt. Ermöglichen Sie nach diesem Backen Schritt die Wafer auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Überspringen Sie für eine einschichtige mikrofluidischen Gerät Schritt 1.2.7. Wiederholen Sie für eine vielschichtige mikrofluidischen Gerät die Schritte 1.2.1 – 1.2.5 für die zweite Schicht der Fotolack (Abbildung 1 b). Im Anschluss an die ersten harten Backen für eine einlagige Gerät (oder der zweiten harten Backen für eine vielschichtige Gerät) entwickeln Sie die Wafer durch Eintauchen in ein Bad aus Propylenglykol Monomethyl Äther Acetat (PGMEA) für 30 min. Verwenden Sie nach der Wafer-Entwicklung eine Spritzflasche mit PGMEA auf um den Wafer zu spülen. Dann abspülen des Wafers mit einer Spritzflasche mit Isopropanol vor Inverkehrbringen eine Herdplatte 135 ° C für 1 min trocknen lassen. Legen Sie die Wafer (im folgenden als Master bezeichnet) in einer Petrischale für den Guss mit Polydimethylsiloxan (PDMS). Fahren Sie mit dem Master in Schritt 1.2 vorbereitet mit die Gerät-Fertigung mit einem PDMS-Casting durchführen. Bereiten Sie die PDMS durch die Kombination einer Silikons-Basis mit einem härter in einem 11:1-Verhältnis von Masse. Mischen Sie die Silikon-Basis und Härtemittel mit einem Stock rühren von hand. Entgasen Sie die PDMS, indem es in eine entgasungskammer und Anlegen eines Vakuums. Ermöglichen die PDMS zu entgasen, bis die Luftblasen nicht mehr sichtbar sind (in der Regel 30 min). Gießen Sie vorsichtig entgast PDMS über dem Meister, zu einer endgültigen PDMS-Schichtdicke von ca. 5 mm. Degas PDMS erneut, um das Entfernen von Luftblasen zu gewährleisten. Backen Sie nach der Entgasung der PDMS und der Meister bei 80 ° C 80 min.. Sorgfältig Verbrauchsteuern der ausgehärteten PDMS-Platte vom gebackenen Meister mit einer Rasierklinge. Sicherstellen Sie, dass alle Kürzungen auf die Silizium-Wafer.Hinweis: Kürzungen aus der Silizium-Wafer können eine Lippe verhindern eine gleichmäßige Verklebung führen. Stanzen Sie die ein- und Ausläufe mit einem 0,75 mm-Biopsie-Punch. Entfernen Sie Staub und streunende PDMS mit einer Verpackungsklebeband auf der Feature-Seite des Gerätes. Vor dem Plasma behandelt das Gerät reinigen Sie einen Objektträger 50 x 75 mm mit Isopropanol abspülen und trocknen. Legen Sie für die Plasmabehandlung die PDMS Platte und Glas Folie in den Plasma-Bonder mit den Merkmalen nach oben. Führen Sie die Plasmabehandlung mit 1 Mbar O2 Plasma für 1 min. Bond das Gerät auf das Glas schieben bringt die ausgesetzt oder aufgedeckt, zusammen Seiten. Im Anschluss an die Plasmabehandlung Backen Sie das Gerät bei 80 ° C für 40 Minuten. Schließlich Spritzen Sie Glas Oberflächenbehandlung Flüssigkeit in einer der Buchten mikrofluidische Kanäle hydrophobe rendern. Stellen Sie sicher, alle Kanäle sind mit der Lösung völlig überflutet und wiederholen Sie die Injektion für jedes Dropmaker. Backen Sie die behandelten Gerät bei 80 ° C für 10 min überschüssiges Lösungsmittel verdunsten. 2. die Verkapselung von Zellen in Agarose Mikrogele Hinweis: Siehe Abbildung 2A. Bereiten Sie 1 mL 3 % w/V niedrig schmelzende Temperatur Agarose 1 x Puffer Tris-EDTA (TE). Halten Sie die Agarose-Lösung auf eine 90 ° C Hitze Block bis unmittelbar vor der Spritze laden. Bereiten Sie die Zellsuspension.Hinweis: Dieses Protokoll und die damit verbundenen mikrofluidischen Geräte wurden validiert mit bakteriellen Zellen aus einer gefrorenen Lager oder frische Zubereitung zu arbeiten. Säugerzellen, je nach Zelltyp, erfordern eine Anpassung der mikrofluidischen Kanal Dimensionen größeren Zellgrößen unterzubringen. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Zählen der Zellen in einem Hemocytometer oder durch Strömung zu sortieren. Bereiten Sie 25 µm mikrogele mit einer Zelle Kapselung-zielrate von 1: 10 1 mL Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 2,4 x 107 Zellen/mL. Die Zellen Spin-down bei 3.000 x g für 3 min. Aspirat überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL 17 % V/V Dichte Gradienten Medium (siehe Tabelle der Materialien) mit PBS-Puffer. Halten Sie es auf Eis, bis die Spritze laden. Laden Sie eine 3-mL-Spritze mit fluorierten Öl (HFE) mit einer 2 % w/w Perfluoropolyether-Polyethylen-Glykol (PFPE-PEG) Tensid zu, mit einer 27 G Nadel passen Sie und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe.Hinweis: Passen alle Spritzen mit einer 27 G Nadel für die Mikrofluidik Schritte in diesem Protokoll. Um das Risiko von unbeabsichtigten stechen lassen Sie Kappen auf allen Nadeln bis Pumpenbetrieb beginnt. Laden Sie die Zellsuspension und flüssige Agarose in 1 mL Spritzen, passen Sie beide mit 27-Gauge Nadeln und legen Sie diese in Spritzenpumpen. Halten Sie die Agarose-Spritze und die Pumpe mit einer kleinen Raum-Heizung zu verhindern, dass die Agarose Gelbildung in der Spritze und Zulauf Schlauch warm. Der Warmlufterzeuger auf HIGH gesetzt und positionieren Sie es so, dass die Heizfläche ca. 10 cm entfernt von der Spritze ist. Sicherzustellen Sie, dass die Temperatur gemessen an der Spritze ca. 80 ° C.Hinweis: Benutzer werden empfohlen, die Heizung bei der empfohlene Abstand von den pumpenden Apparat zur Verringerung des Risikos von Sachschäden, einschließlich Schmelzen des Schlauches zu pflegen. 25 µm Microgel Tropfen mit dem Co-Flow Dropmaking Gerät zu generieren.Hinweis: Siehe Abbildung 3A für ein Gerät schematische Angabe der Lage des Reagenz Buchten und Steckdose. Schließen Sie die Spritze Nadeln an der mikrofluidischen Gerät Buchten mit Stücken von Polyethylen (PE) Schläuche. Bevor die Rohre in das Gerät einlegen, prime die Pumpen um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Schließen Sie ein Stück Schlauch an die Steckdose an und das freie Ende in eine 15 mL sammelröhrchen. Verwenden Sie die folgenden (empfohlen) Durchflussmengen für Dropmaking: 800 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG; 200 µL/h für die Zellsuspension mit PBS-Puffer; und 200 µL/h für 3 % w/V Agarose. Legen Sie nach der Dropmaking dem Sammelrohr bei 4 ° C für 30 min um die komplette Gelierung der Agarose zu gewährleisten. 3. brechen und waschen die Agarose-Mikrogele Entfernen Sie die untere Schicht des Öls aus dem Sammelrohr mit einer 3 mL Spritze, ausgestattet mit einer 20 G-Nadel, kümmert sich nicht um die oberste Schicht der Agarose Tröpfchen zu stören. Brechen Sie die Emulsionen mit Perfluorooctanol (PFO). Die Agarose-Tropfen 1 mL 10 % V/V PFO in HFE hinzufügen. Pipettieren diese Lösung oben und unten für 1 min gründlich die Emulsionen beschichtet.Hinweis: Für die Microgel waschen Schritte, pipettieren der Lösungen mit 1.000 µL Spitze. Die Microgel Suspension sollte homogen und frei von Klumpen nach pipettieren sie angezeigt werden. Drehen Sie das konische Rohr auf 2.000 x g für 1 min um die Agarose-mikrogele zu sammeln. Entfernen Sie den PFO/HFE Überstand durch Aspiration; die mikrogele sind jetzt frei von ihrer Tensid-Schicht und klar erscheint. Gewaschen Sie mikrogele mit einem Tensid in Hexan werden.Achtung: Hexan ist eine flüchtige organische Lösungsmittel, und die Wäsche im Schritt 3.3 in einem Abzug durchgeführt werden. Fügen Sie 2 mL 1 % V/V Sorbitan Monooleate nichtionische Tenside (siehe Tabelle der Materialien) in Hexan, die Agarose-mikrogele. Pipettieren nach oben und unten 10 X mischen, gewährleistet die vollständige Trennung der Microgel pellet. Drehen Sie das Rohr auf 1.000 x g für 1 min um die mikrogele zu sammeln. Aspirieren des Überstands um die Tensid/Hexan Lösung zu entfernen. Wiederholen Sie die Tensid/Hexan zu waschen. Waschen Sie die mikrogele in einem wässrigen Puffer für jede verbleibende organische Lösungsmittel zu entfernen. Fügen Sie 5 mL TET Puffer [0,1 % V/V Octylphenol Nonylphenolethoxylat nichtionische Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien) in 1 X TE] mit dem konischen Rohr. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen. Drehen Sie das konische Rohr auf 2.000 x g für 2 min die mikrogele zu sammeln. Aspirieren des Überstands um die TET-Puffer zu entfernen. Wiederholen Sie TET Waschen 2 X. Das konische Rohr 5 mL 1 X TE-Puffer hinzufügen. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen. Drehen Sie das konische Rohr auf 2.000 x g für 2 min die mikrogele zu sammeln. Aspirieren des Überstands um die TE-Puffer zu entfernen. Wiederholen Sie die TE zu waschen. Überprüfen der Zelle Kapselung in mikrogele unter dem Mikroskop bei 400 X Vergrößerung durch Färbung einer 10 µL aliquoten Gele mit 1 X Nukleinsäure Fleck (siehe Tabelle der Materialien).Hinweis: Mikrogele erscheint deutlich unter dem transparenten Kanal während der Zelle, die DNA wird unter den GFP-Kanal (497/520 nm Anregung/Emission Wellenlängen) fluoreszieren. Eine Überlagerung der transparenten und fluoreszierende Kanäle zeigen die Zellen in der mikrogele, wie in Abbildung 4A. 4. die Lyse der Zellen in Agarose über lytischen Enzymen Bereiten Sie 1 mL eine lytische Enzym-cocktail mit 800 µL TE-Puffer (1 X) 2 µL der Hefe lytische Enzym (5 U/µL bestand, Letzte 10 U/mL), 30 µL Dithiothreitol (1 M Lager, Letzte 30 mM), 60 mg Lysozym (lyophilisierte Pulver), 15 µL EDTA (0,5 M Lager Letzte 7,5 mM), 2 µL des Mutanolysin (100 U/µL bestand, endgültige 200 U/mL), 2 µL Lysostaphin (10 U/µL bestand, 20 U/mL final) und 30 µL NaCl (1 M bestand, Letzte 30 mM). Fügen Sie zusätzliche TE um das Volumen zu 1 mL zu bringen. Mischen Sie die Lösung durch aufschütteln. Die gesamte 1 mL der Enzymlösung lytische zu nicht mehr als 1 mL der gewaschenen mikrogele hinzufügen. Durch pipettieren 10 X mischen. Die Mischung bei 37 ° C inkubieren > 2 h in einem Shaker (das Maximum ist über Nacht Inkubation). 5. Reinigungsmittel-basierte Microgel Behandlung Im Anschluss an die Lyse über lytischen Enzymen (Schritt 4) Waschen der mikrogele. Spin-down der mikrogele 2.000 x g für 2 min und den überstand abgesaugt. Die Tröpfchen werden Deckweiß durch Zelle Trümmer verstreut im Pellet angezeigt. Aufschwemmen der mikrogele in 5 mL 10 mM Tris-HCl-Puffer und pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen. Spin-down das Gemisch bei 2.000 x g für 2 min, dann entfernen Sie den Überstand durch Absaugen. Führen Sie eine reinigende Behandlung auf die mikrogele. Die Gele in einem Lithium Dodecyl Sulfat (Deckel) Lysis Puffer Aufschwemmen (0,5 % w/V Deckel in 20 mM Tris-HCl) und 60 µL 0,5 M EDTA zu einem Endvolumen von 3 mL. 5 µL ein Enzym Proteinase K (800 U/mL Brühe) hinzufügen. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen, dann brüten die Mischung bei 42 ° C auf einem Heizblock für 1 h nach lösen der Zellmembranen und Proteine zu verdauen. Im Anschluss an die reinigende Behandlung Waschen der mikrogele. Spin-dem konische Rohr mit der mikrogele down bei 2.000 x g für 2 min. Entfernen des Überstands durch Absaugen. Mikrogele mit 10 mL 2 % V/V Polysorbat 20 im Wasser zu waschen. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen. Das konische Rohr Spin-down bei 2.000 x g für 2 min, dann den Überstand durch Absaugen entfernen. Waschen Sie die mikrogele mit 10 mL 100 % Ethanol, jede verbleibende Enzym zu inaktivieren. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen. Das konische Rohr Spin-down bei 2.000 x g für 2 min, dann den Überstand durch Absaugen entfernen. Mikrogele mit 10 mL von 0,02 % V/V Polysorbat 20 im Wasser zu waschen. Pipettieren nach oben und unten 10 X zu mischen. Das konische Rohr Spin-down bei 2.000 x g für 2 min, dann den Überstand durch Absaugen entfernen. Wiederholung der Polysorbat 20 Waschen 3 X. Übergeben Sie die Lösung durch ein 100 µm Zelle Sieb vor dem letzten Waschen, großen Klumpen zu entfernen. Aufschwemmen der mikrogele in 5 mL 10 mM Tris-HCl-Puffer, um DNA-Abbau zu verhindern. Die mikrogele können bis zu 1 Woche vor der Tagmentation (Schritt 7) bei 4 ° C aufbewahrt werden. 6. Erzeugung von Barcode Tröpfchen durch digitale PCR Bereiten Sie einen 500-Uhr bestand von BAR Grundierung (Tabelle 2) in einem 1 x TE-Puffer in einem Low-Bind-Rohr. Vor jedem Gebrauch verdünnen die Grundierung arbeiten bestand von 13:00 und Erhitzen auf 70 ° C für 1 min auf einem Heizblock. Bereiten Sie eine 150 µL PCR Reaktion Mischung mit 75 µL High-Fidelity-Heißstart Meister mischen (siehe Tabelle der Materialien) (2 X), 42 µL 3 µL P7_BAR Grundierung (10 µM bestand, PCR-Grade Wasser, 3 µL DNA_BAR Grundierung (10 µM Lager, endgültige 0,2 µM) Letzte 0,2 µM), 6 µL Barcode Verdünnung (13:00-Lager, 40 fM final), 6 µL Polysorbat 20 (50 % V/V Lager, 2 % final) und 15 µL PEG 6 k (50 % w/V Lager, 5 % final). Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 10 X pipettieren. Bereiten Sie eine HFE-backed Spritze durch Zeichnen von 200 µL des HFE Öl in eine Spritze und passen Sie es mit einer Nadel. Befestigen Sie die Nadel einen Teil von PE-Rohre und prime die Linie von hand. Stecken Sie das Ende des PE-Rohres in der Ziellösung und zeichnen Sie sorgfältig alle 150 µL des PCR-Mixes in die PE-Schlauch und Spritze. Laden Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe. Laden Sie eine 1 mL Spritze mit fluorierten Öl (HFE), enthält ein 2 % w/w Perfluoropolyether-Polyethylen-Glykol (PFPE-PEG)-Tensid, passen Sie es mit einer Nadel und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe. 25 µm-Barcode-Tropfen mit dem Co-Flow Dropmaking Gerät zu generieren.Hinweis: Siehe Abbildung 3A für ein Gerät schematische Angabe der Lage des Reagenz Buchten und Steckdose. Stecker der Zellen Einlass eines Co-Flow-Dropmaker-Geräts mit einem kleinen Stück Blei Löten. Schließen Sie die Spritzen mit HFE geladen und PCR mix, der mikrofluidischen Gerät Buchten mit Stücken von PE-Schlauch, mit dem Geschmolzenen Agarose -Einlass für den Barcode PCR Mischung. Bevor die Rohre in das Gerät einlegen, prime die Pumpen um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Schließen Sie ein Stück Schlauch an die Steckdose an und das freie Ende in ein 0,2 mL PCR-Tube. Verwenden Sie die folgenden (empfohlen) Durchflussmengen für Dropmaking: 600 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG und 200 µL/h für den PCR-Mix. Sammeln Sie die Tropfen in die PCR-Röhrchen mit etwa 50 µL der Tropfen in jedes Rohr. Entfernen Sie nach der Dropmaking vorsichtig die untere Schicht der HFE-Öl aus der Emulsionen mit Gel-Loading pipettieren Tipps und ersetzen Sie es mit FC-40 fluorierten ölhaltigen ein 5 % w/w PFPE-PEG Tensid. Thermischen Zyklus mit das folgende Protokoll: 98 ° C für 3 min, 40 X (98 ° C für 10 s, 62 ° C für 20 s, 72 ° C für 20 s), 72 ° C für 5 min und dann Halt bei 12 ° C.Hinweis: Die thermische radelte Tröpfchen können bei 4 ° C bis zu 1 Tag aufbewahrt werden. Überprüfen Sie die Barcode-Verstärkung und Kapselung-Rate. Bereiten Sie eine 1 X Nukleinsäure in HFE färben (siehe Tabelle der Materialien), mit einer 2 % w/w PFPE-PEG Tensid; der Fleck ist geringfügig mischbar in HFE und Binden an die DNA in den Tröpfchen. 1 µL Thermal radelte Barcode-Emulsion zu 10 µL Färbung Öl hinzufügen. Inkubieren sie 5 min bei Raumtemperatur. Bild von Tröpfchen durch Fluoreszenz-Mikroskopie (GFP Kanal, 497/520 nm Anregung/Emission Wellenlängen) bei 200 X Vergrößerung und zählen die Barcode-Kapselung-Rate. Beachten Sie, dass das Signal diskret sein wird: die Tröpfchen mit verstärkten Barcodes fluoreszieren hell, während die leere Tropfen dunkel erscheint (Abbildung 4 b). 7. Tagmentation Genomic DNA in Tröpfchen Hinweis: Siehe Abb. 2 b. Bereiten Sie 500 µL Tagmentation Lösung mit Reagenzien von Next Generation Sequencing Bibliothek Vorbereitung kit (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie 7 µL Tagmentation Enzym, 250 µL Tagmentation-Puffer und 243 µL des PCR-Grade Wasser. Durch Vortexen mischen und die Mischung spin-down um zu sammeln. Laden Sie diese Lösung in einer HFE Öl-backed 1 mL Spritze und passen Sie es mit einer Nadel. Die Reinjektion der mikrogele vorbereiten. Spin-down der Microgel Tube für 2 min bei 2.000 x g und den überstand abgesaugt. 200 µL des Gels an die Spitze der eine HFE-backed Spritze mit einer Gel-Loading pipettieren Spitze zu übertragen und die Düse mit einem kleinen Stück Klebeband verschließen. Mithilfe eines Adapters 3D-gedruckten Zentrifuge (siehe ergänzende Dateien 1 und 2), drehen die Microgel Spritze für 3 min bei 3.000 x g. Entfernen Sie die flüssigen überstand aus der Spritze mit einer Gel-Loading pipettieren Spitze. Drücken Sie die Microgel-Schicht auf der Basis der Spritze Düse. Passen Sie die Spritze mit einer Nadel. Laden Sie eine 3 mL Spritze mit fluorierten Öl (HFE) mit einer 2 % w/w Perfluoropolyether-Polyethylen-Glykol (PFPE-PEG)-Tensid, passen Sie es mit einer Nadel und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe. Neu Kapseln der mikrogele in Tröpfchen mit Tagmentation Reagenzien.Hinweis: Siehe Abb. 3 b für ein Gerät schematische Angabe der Lage des Reagenz Buchten und Steckdose. Schließen Sie die Spritzen mit HFE, Tagmentation Mix und mikrogele zu den mikrofluidischen Gerät Einlässen mit Stücken von PE-Rohren. Bevor die Rohre in das Gerät einlegen, prime die Pumpen um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Schließen Sie ein Stück Schlauch an die Steckdose an und das freie Ende in eine leere 1-mL-Spritze mit den Kolben auf die 1 mL-Linie gezogen. Verwenden Sie die folgenden (empfohlen) Durchflussmengen für Dropmaking: 2.000 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG, 200 µL/h für die mikrogele und 500 µL/h für die Tagmentation Mix. Überprüfen Sie die Microgel Kapselung Rate unter einem Lichtmikroskop bei 400 X Vergrößerung. Ca. 80-90 % der Tropfen sollte ein Microgel enthalten, wie in Abbildung 4dargestellt. Passen Sie die Spritze mit der Tagmentation-Emulsionen mit einer Nadel und inkubieren Sie es aufrecht in einem Heizblock oder Backofen für 1 h bei 55 ° C um die genomische DNA fragment. 8. Single-Cell Barcoding von mikrofluidischen Double Fusion Hinweis: Siehe Abbildung 2. Bereiten Sie die Barcode-Tropfen für die Fusion indem die FC-40 ölfraktion mit HFE 2 % w/w PFPE-PEG. Sorgfältig übertragen Sie diese Tropfen in eine 1 mL Spritze mit einer Nadel passen Sie und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe. Laden Sie die inkubierten und Tagmented Microgel Tröpfchen Spritze in eine Spritzenpumpe. Bereiten Sie 500 µL des PCR-Mixes. Fügen Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge zu verhindern, dass Ausscheidungen bilden: 140 µL des PCR-Grade Wasser, 10 µL der P5_DNA Primer (10 µM Lager, endgültige 0,2 µM), 10 µL der P7_BAR Primer (10 µM Lager, endgültige 0,2 µM), 50 µL PEG 6k (50 % w/V bestand 5 % final), 50 µL Polysorbat 20 (50 % V/V Lager, 5 % final), 250 µL Taq Master Mix (2 X) (siehe Tabelle der Materialien), 10 µL der Isothermen Polymerase (siehe Tabelle der Materialien), und 10 µL der Neutralisation Puffer (siehe Tabelle der Materialien). Mischen sie von oben und unten 10 X pipettieren und spin-down der Mischung, um es zu sammeln. Laden Sie diese Lösung in einer 1-mL-Spritze mit HFE-backed, passen Sie es mit einer Nadel, und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe. Laden drei 3 mL Spritzen mit fluorierten Öl (HFE), enthält ein 2 % w/w Perfluoropolyether-Polyethylen Glykol (PFPE-PEG) Tensid passen jeweils mit einer Nadel und legen Sie sie in Spritzenpumpen. Laden Sie drei 1 mL Spritzen mit 2 M NaCl, passen Sie jeweils mit einer Nadel und legen Sie sie beiseite. Die Barcode-Tröpfchen, Tagmented Genom Tröpfchen, zusammenführen und PCR Mischung mithilfe der doppelten Fusion-Gerät.Hinweis: Siehe Abbildung 5 für ein Gerät schematische Angabe der Lage des Reagenz und Elektrode Buchten und Steckdose. Die 3 NaCl Spritzen an die 2 Elektrode Buchten und single Stadtgraben Inletusing Stücke von PE-Schlauch anschließen. Für die Elektroden Druck auf die Spritzen manuell bis die Elektroden vollständig mit Kochsalzlösung gefüllt sind. Nach dem Befüllen Druck die Elektroden manuell an der Wassergraben Spritze bis der Graben gefüllt ist. Stecken Sie das freie Ende des Grabens mit einem kleinen Stück von Bleilot. Schließen Sie die 3 HFE-Spritzen auf Pumpen 2 Abstandhalter öleinführungen und Dropmaking Öl Inletusing Stücke von PE Schlauch montiert. Bevor die Rohre in das Gerät einlegen, prime die Pumpen um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Schließen Sie die PCR Mischung Spritze, Microgel sinkt Spritze und Barcode sinkt Spritze auf ihre jeweiligen Buchten mit PE-Schlauch. Schießen Sie alle Tröpfchen Reinjektion Schläuche mit einem antistatischen Pistole vor dem Anschluss an die Spritze Nadeln; die antistatische Behandlung verringert das Risiko von Tröpfchen Koaleszenz induziert durch statische Aufladungen auf den PE-Schlauch. Schließen Sie ein Stück PE-Schlauch an die Steckdose an und das freie Ende in ein 0,2 mL PCR-Tube. Verbinden Sie die Nadel der Spritze Elektrode mit einem Kaltkathoden Leuchtstofflampen Wechselrichter mit einer Krokodilklemme. Setzen Sie den Wechselrichter DC-Stromversorgung auf 2 V. Laufen die doppelte Fusion-Gerät mit der empfohlenen Volumenströme: 300 µL/h für die Tagmented Microgel Tropfen, 100 µL/h für die Barcode-Tropfen, 1500 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG (Dropmaking Öl), 600 µL/h für die Amplifikation mischen, 200 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG () Barcode-Abstandhalter-Öl), und 700 µL/h für die HFE 2 % w/w PFPE-PEG (Microgel Abstandhalter Öl). Sammeln Sie die Tropfen in PCR-Tubes mit etwa 50 µL der Emulsion in jedem Röhrchen. Entfernen Sie vor die Temperaturzyklen vorsichtig die untere Schicht der HFE-Öl aus der Emulsionen mit Gel-Loading pipettieren Tipps und ersetzen Sie sie durch FC-40 fluorierten ölhaltigen ein 5 % w/w PFPE-PEG Tensid. Thermischen Zyklus mit das folgende Protokoll: 65 ° C für 5 min, 95 ° C für 2 min, 30 X (95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min, 72 ° C für 1 min), 72 ° C für 5 min, dann Halt bei 12 ° C. Erholen Sie der Barcode DNA von der thermischen Gefahren Tröpfchen. Die Tröpfchen zu einem Microcentrifuge Schlauch zu bündeln und die Emulsionen mit 20 µL des PFO zu brechen. Wirbel für 10 s zu mischen. Drehen Sie das Rohr auf 10.000 x g für 1 min um die Mischung in wässrigen (oben) und Öl (unten) Phasen fraktionieren. Sorgfältig Entfernen der oberen wässrigen Schicht aus der Tube mit einem pipettieren und überträgt es auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch. Verwerfen der Ölphase. Reinigen Sie das Barcode-PCR-Produkt in einer Spin-Spalte nach der Hersteller-Protokoll und in 20 µL 1 X TE-Puffer eluieren. Fahren Sie mit der durchgeführten Sequenzierung und Analyse nach Schritte 9 und 10. 9. Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung Vorbereiten der einzelligen Bibliothek für die Sequenzierung von der Hersteller-Protokolle für Fragment Größenauswahl und Quantifizierung. Reihenfolge der gepaart-End-Bibliothek mit Standard-Chemie für Lesen 1 und 2 lesen. Verwenden Sie den benutzerdefinierten Index 1 Primer I7_READ (Tabelle 2) für einen 15-bp-Index lesen, entsprechend des einzelligen Barcodes. 10. einzellige Datenanalyse Hinweis: Benutzerdefinierte Python-Skripte zur Qualitätskontrolle und vorläufige Analyse der SiC-Seq-Daten können von https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq heruntergeladen werden. Führen Sie das Skript “barcodeCleanup.py” um Qualitätskontrolle auf der Barcodes liest und die Single-Cell-Daten in eine SQLite-Datenbank exportieren. Für ein kontrollexperiment, verwenden Sie dieses Skript mit der “-ausrichten” flag gesetzt, der liest mit bekannten Referenz Genomen auszurichten. Analysieren Sie die Reinheit der Barcode-Gruppen (für ein kontrollexperiment) mit dem Skript “purity.py” und bestätigen Sie die hohe Reinheit Werte entsprechen Abbildung 6 b.