JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Published: May 23, 2018
doi:
10.3791/57598
, , ,
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences,University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering,University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif > 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Abstract

Sıralama teknolojileri üzerinden toplu bir paradigma kayması tek hücreli çözünürlükte yanıt-e doğru hücresel heterojenite rolü gelişen bir anlayış biyolojik sistemlerde uğramıştır. Ancak, tek hücreli sıralama büyük nüfusun by kısıtlamaları genleri sıralama için işleme engel olmuştur. Bu yazıda, tek kişilik hücrelerin genleri izole, yükseltmek için damlacık Havacilik kullanır tek hücreli genom sıralama (SiC-seq) ve barkod için bir yöntem açıklanmaktadır. Microgels hücre katma sağlar compartmentalized arıtma ve tagmentation DNA, bir mikrosıvısal birleşme verimli bir şekilde her genom benzersiz tek hücreli oligonükleotid barkod ile çiftleri iken izin > sıralı için 50.000 tek hücreler Çalıştır. Sıralama veri barkod, tek hücrelerden kaynaklanan okuma grupları oluşturma tarafından demultiplexed. Yüksek işlem hacmi ve düşük-önyargı yöntemi tek hücreli sıralama olarak, SIC seq genomik çalışmalar çeşitli hücre popülasyonlarının hedef daha geniş bir dizi sağlayacaktır.

Introduction

Hücresel kimlik ve işlevi, bir organizmanın tamamını içeren bir plan potansiyel kodlama’nın genom hizmet vermektedir. Genom düzeyinde Hücresel biyoloji bir anlayış türdeş olmayan hücre popülasyonlarının içinde gözlenen fenotipik çeşitlilik açıklayabilir. Bu heterojenlik biyolojik sistemlerde belirgindir ve insan sağlığı ve hastalığı geniş etkiler. Örneğin, tümör hücreleri arasında gen kopya numarası varyasyonlar evrim ve yayılmasını kanseri1,2bağlıdır. Bakteriyel enfeksiyonlar, patojen Adaları genleri küçük bir kısmını mevcut yatay olarak transfer edilebilir ve için belgili tanımlık hızla çoğalmak-in antibiyotik dirençli bakteri3,4kurşun. Genleri tek hücre düzeyinde eğitim bir birincil DNA elde edilebilir, aynı zamanda hücreleri binlerce analiz etmek gerek genotip tam çeşitliliği örnek için düşük miktarlarda mücadeledir. Bu nedenlerden dolayı deneysel üretilen iş kısıtlamalar yapılan çalışmaların sonuçları en bol hücreler doğru kutuplama tek hücreli, etkinliğini engel. Sıralama5,6, Optik cımbız7, toplu jelleri8ve havacilik9 olarak sıkıştırılma akışı gibi tek hücreli yalıtım teknikleri hücreler sıralama için yüzlerce işleyebilme yeteneği olan; Ancak, bu çoğu örnekleri yalnızca küçük bir kısmını temsil eder. Tek hücreli genom sıralama ile önemli ölçüde daha yüksek üretilen iş için bir yöntem daha derin ve daha kapsamlı hücre popülasyonlarının, böylece bu topluluklar içinde genotypic çeşitlilik rolü elucidating profilleme sağlayacak.

Damlacık Havacilik hücreleri ve biyolojik kimyasalları picoliter ölçekli reaktörler milyonlarca içinde yüksek-den geçerek manipülasyon sağlar. Türdeş olmayan doku10,11,12, hücreleri arasında fark ifade desen çalışması için kullanılan teknolojiler microdroplet bugüne kadar derin uzun moleküller13,14 sıra ,15ve davranış kromatin immunoprecipitation sıralama (ChiP-seq) analizleri tek hücreleri16. Gerçekten de, microdroplets yüksek üretilen iş, bölümlere işlemleri, tek hücreli genomik uygulamalar için mükellef yapma yeteneğine sahiptirler. Bu teknoloji geliştirme ancak kendi benzersiz teknolojik sorunlar sunar. Hücreleri lysed saflaştırılmış ve aynı şekilde örnek hücre popülasyonlarının için en az önyargı ile güçlendirilmiş. Ayrıca, memeli hücrelerinde poliadenile mRNA transkript var. hiçbir karşılaştırılabilir moleküler motifi hedef nükleik asit yakalanması kolaylaştırmak için genom Bu nedenlerden dolayı tek hücreli genom sıralama microdroplet platformlarında uygulamak zor olmuştur.

Bu çalışmada, biz daha önce raporlanmış tek hücreli mikrosıvısal yaklaşımımız bir tek deneme17hücrelerde, on binlerce genleri sıralama yetenekli detaylı bir protokol sağlar. SiC-seq, adı verilen bu teknoloji sayesinde bakteri hücreleri mikron çaplı hydrogels içinde kapsüllenir ve tek tek lysed, tagmented ve genomik DNA hücrenin üzerine spliced benzersiz oligonükleotid barkod içeren bir microdroplet ile birleştirilmiş bir tek örtüşme uzantısı polimeraz zincir tepkimesi (PCR). Hydrogels izole konteyner içinde yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA sterically, deterjanlar ve erişmek ve barkodlama18önce DNA arındırmak için litik enzimler gibi daha küçük moleküller izin kaplı olarak hizmet vermektedir. Bu iletişim kuralı işler > saatler, barkodlu kütüphane sıralama için hazır sonuçlanan 50.000 tek hücreler. Nasıl yapılacağını takiben, okuma, okuma, milyonlarca oluşan bir dataset her hücresel bir dizin ile sonuçlanan onların tek hücreli barkod sırasına göre demultiplexed.

Protocol

1. mikrosıvısal cihaz imalat Mikrosıvısal (olarak sağlanan. bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak maske tasarımlar hazırlamak DWG; Takıma giren bkz: Dosyaları). Bir devre kartı film 10 µm çözünürlükle satıcı tarafından basılan bu tasarımları var.Not: çok katmanlı mikrosıvısal aygıtlar için karşılık gelen maskeleri hizalama işaretlerini içerir. Her aygıt için SU-8 Ana kalıp (Şekil 1A) aşağıdaki gibi imal. 3 – inç çapında silikon gofret yaklaşık 1 mL SU-8 3025 fotorezist gofret merkezi dökerek hazırlayın. Gofret spin coater üzerinde emme uygulayarak chuck güvenli. Katman kalınlıklarının bir listesi için bkz: Tablo 1 ve her aygıt için hız spin. Tüm aygıtlar için spin kaplama 30 ile başlamak s 500 rpm’de takip 30 tarafından belirtilen hızda s. SU-8-silikon gofret spin coater ve yumuşak fırında 30 dakika süreyle 135 ° c ayarla bir ocağın üzerinde izin pişirme sonra oda sıcaklığında soğumaya gofret kaldırın. SU-8-silikon gofret uygun mikrosıvısal maskesi altında bir collimated 190-mW, 365 nm UV LED 3 min için maruz. Maruz kaldıktan sonra 135 ° c için 1 dk zor fırında gofret bir ocağın üzerinde ayarlayın. Pişirme bu adımı oda sıcaklığında soğumaya gofret ver. Bir tek katmanlı mikrosıvısal aygıt için 1.2.7 adıma atlayın. Bir çok katmanlı mikrosıvısal aygıt için adımları 1.2.1 – 1.2.5 fotorezist (Şekil 1B) ikinci katmanı için yineleyin. Bir tek katman aygıtı (ya da çok katmanlı bir aygıt ikinci sabit fırında) için ilk sabit fırında, gofret propilen glikol monomethyl eter asetat (PGMEA) 30 dk için banyo içine çeker tarafından geliştirmek. Sonra gofret’ın geliştirme, PGMEA içeren bir fışkırmak şişe gofret durulama için kullanın. O zaman gofret kuruması 1 dk için 135 ° C ocağın üzerinde yerleştirmeden önce isopropanol içeren bir fışkırmak şişe ile durulayın. (Bundan böyle Yöneticisi olarak adlandırılır) gofret bir petri polydimethylsiloxane (PDMS) ile döküm için yerleştirin. 1.2. adımda hazırlanan usta ile cihaz imalat PDMS döküm ile gerçekleştirmek için devam edin. PDMS kitle tarafından 11:1 oranında bir kür maddesi ile bir silikon temel birleştirerek hazırlayın. Silikon taban ve kür Aracı el ile heyecan sopa ile karıştırın. PDMS gaz giderme bir odaya yerleştirerek ve bir vakum uygulayarak degas. Hava kabarcıkları artık görünür hale gelene kadar degas PDMS izin (genellikle 30 dakika). Dikkatle degassed PDMS asıl, son PDMS-katman kalınlığı, yaklaşık 5 mm. Degas yeniden herhangi bir hava kabarcıkları kaldırılmasını sağlamak için PDMS üzerine dökün. Gaz giderme sonra PDMS ve master için 80 dk 80 ° C’de pişirin. Dikkatle tedavi PDMS levha bir jilet kullanarak pişmiş ana tüketim. Tüm kesimler üzerine silikon gofret olduğundan emin olun.Not: tek tip bir bağ engelleyen bir dudak silikon gofret yapılan herhangi bir kesim neden olabilir. Giriş ve çıkışları kullanarak bir 0,75 mm biyopsi yumruk yumruk at. Herhangi bir toz ve sokak PDMS cihazın özelliği tarafında bir ambalaj bant kullanarak kaldırın. Cihazın tedavi plazma önce 50 x 75 mm cam slayt isopropanol ile durulama ve kurutma temiz. Plazma tedavisi için plazma bonder PDMS levha ve cam slayta özellikleriyle yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. 1 dk. cam aygıta maruz getirerek slayt veya, yüz Bond birlikte taraf için 1 mbar O2 plazma ile plazma tedavi gerçekleştirmek. Plazma tedavi 80 ° C’de aygıt için 40 dk pişirin. Son olarak, cam yüzey işleme sıvı bir mikrosıvısal kanalları hidrofobik işlemek için giriş içine enjekte. Tüm kanallar ile çözüm tamamen su basmış ve enjeksiyon her dropmaker için tekrar emin olun. Tedavi cihaz aşırı solvent buharlaşır 10 dk 80 ° C’de pişirin. 2. özel Microgels hücrelerde kapsülleme Not: Şekil 2Abakın. 1 mL % 3 w/v düşük erime sıcaklığı özel 1 Tris-EDTA (TE) arabellek x hazırlamak. Özel çözüm hemen yükleniyor şırınga kadar önce 90 ° C ısı blokta tutun. Hücre süspansiyon hazırlamak.Not: Bu protokol ve onun ilişkili mikrosıvısal aygıt bakteri hücreleri, donmuş hisse senedi veya taze hazırlık çalışmak için doğrulanmış. Memeli hücreleri, hücre türüne bağlı olarak bir mikrosıvısal kanal boyutlarının daha büyük hücre boyutlarının düzeltilmesi gerekebilir. Fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 mL hücrelerde resuspend. Bir hemasitometre veya akışı sıralama hücreleri saymak. Hedef hücre kapsülleme hızıyla 1 10 25 µm microgels için hücre süspansiyon 2.4 x 107 hücre/mL nihai bir konsantrasyon, 1 mL hazırlayın. Spin 3000 x g 3 dk. aspiratı süpernatant de aşağı hücreleri ve hücre pelet 1 mL % 17 v/v yoğunluk gradient orta resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) PBS içinde. Buza kadar şırınga yükleme devam et. Bir % 2 w/w perfluoropolyether-Polietilen glikol (PFPE-PEG) yüzey aktif içeren bir 3-mL şırınga flüorlu petrol (HFE) yük, bir 27 G iğne ile uygun ve bir şırınga pompa yerleştirin.Not: Uygun mikrosıvısal bir 27 G iğne ile tüm şırınga bu protokol için adımları. Yanlışlıkla iğneleyici riskini azaltmak için pompa işlemi başlar kadar tüm iğne falan batmazdı kapaklar tutun. Hücre süspansiyon ve erimiş özel 1 mL şırınga yüklemek 27’lik iğne ile her ikisi de uygun ve bunlar şırınga pompa içine yerleştirin. Özel şırınga ve pompa şırınga ve giriş boru gelling özel önlemek için küçük bir ısıtıcı ile sıcak tut. Isıtıcı yüksek olarak ayarlanmış ve yaklaşık 10 cm uzakta belgili tanımlık tenkıye Isıtma yüzeyidir şekilde konumlandırın. Şırınga ölçülen sıcaklık yaklaşık 80 ° c olduğundan emin olunNot: Kullanıcılar önerilen mesafe pompa ekipman hasar, tüp erime gibi riskini azaltmak için gelen ısıtıcı korumak için önerilir. İş akışı dropmaking aygıtı kullanarak 25 µm microgel damla oluşturmak.Not: Bir aygıt için reaktif giriş ve çıkış konumunu gösteren şematik Şekil 3A bakın. Şırınga iğneleri polietilen (PE) boru parçaları kullanarak mikrosıvısal aygıt giriş bağlayın. Tüpler cihazın içine eklemeden önce hava satırından kaldırmak için pompalar Başbakan. Boru parçası prizine takýn ve ücretsiz sonuna bir 15 mL toplama tüpü yerleştirin. Dropmaking için aşağıdaki (önerilen) akış oranları kullanın: 800 µL/h HFE % 2 w/w PFPE-PEG; 200 µL/h PBS hücre süspansiyon için; ve 200 µL/h %3 w/v özel için. Dropmaking sonra özel tam jelleşme emin olmak 30 dk için 4 ° C’de toplama tüpü yerleştirin. 3. kırma ve özel Microgels yıkama Petrol alt tabakası özel damlacıkları üst tabakası bozmamaya dikkat çekici bir 20 G iğne ile donatılmış 3 mL şırınga kullanarak toplama tüp kaldırın. Emülsiyonlar perfluorooctanol (PFO) ile bölünürler. 1 mL % 10 v/v PFO HFE içinde özel damla ekleyin. Damlalıklı iyice emülsiyonlar kat 1 dk için yukarı ve aşağı bu eriyik.Not: tüm microgel için adımları, yıkama damlalıklı 1.000 µL bahşiş çözümlerle. Microgel süspansiyon homojen ve ücretsiz olarak bu pipetting sonra kümeleri görünmesi gerekir. Özel microgels toplamak 1 dk için 2.000 x g, konik tüp spin. PFO/HFE süpernatant aspirasyon tarafından kaldır; microgels şimdi onların yüzey aktif tabakası ücretsiz ve açık görünür. Microgels ile bir yüzey aktif hekzan içinde yıkayın.Dikkat: Hekzan uçucu organik çözücü olduğunu ve bir duman mahallede adım 3.3 Yıkama yapılmalıdır. 2 mL % 1 v/v sorbitan monooleate Nonyonik yüzey aktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) içinde hekzan özel microgels için. Microgel tam ayrılık sağlanması damlalıklı karıştırmak için 10 x yukarı ve aşağı, cips. Tüp microgels toplamak 1 dk 1000 x g de spin. Yüzey aktif/hekzan çözümü kaldırmak için süpernatant Aspire edin. Yüzey aktif/hekzan yıkama yineleyin. Microgels kalan herhangi bir organik çözücü kaldırmak için sulu bir arabellekte yıkayın. TET arabellek 5 mL ekleyin [%0,1 v/v octylphenol ethoxylate Noniyonik deterjan ( Tablo malzemelerigörmek) 1 x te] konik tüp. Damlalıklı karıştırmak için 10 x yukarı ve aşağı. Konik tüp microgels toplamak 2 min için 2.000 x g de spin. TET arabellek kaldırmak için süpernatant Aspire edin. TET yıkama 2 x tekrarlayın. 1 x TE arabellek 5 mL konik tüp ekleyin. Damlalıklı karıştırmak için 10 x yukarı ve aşağı. Konik tüp microgels toplamak 2 min için 2.000 x g de spin. TE arabellek kaldırmak için süpernatant Aspire edin. TE yıkama yineleyin. 10 µL aliquot ile jelleri, boyama tarafından microgels 400 X büyütme, mikroskopla hücre katma doğrulayın 1 x nükleik asit leke ( Tablo malzemelerigörmek).Not: Microgels açık şeffaf kanalın hücre DNA GFP kanal (497/520 nm uyarma/emisyon dalga boyları) altında belli süre altında görünür. Bir bindirme şeffaf ve floresan kanal hücreleri içinde microgels Şekil 4Agörüldüğü gibi gösterir. 4. özel litik enzimler ile hücrelerinde lizis 1 mL litik enzim TE arabelleği (1 x), Maya litik enzim (5 U/µL stok, 10 U/mL son), dithiothreitol (1 M hisse senedi, 30 mM son), 30 µL 2 µL 800 µL lizozim (liyofilize toz), EDTA (0,5 M stok 15 µL 60 mg kullanarak kokteyl hazırlamak 7.5 mM son), mutanolysin (100 U/µL stok, 200 U/mL son) 2 µL, lysostaphin (10 U/µL stok, 20 U/mL son) 2 µL ve 30 µL NaCl (1 M stok, 30 mM son). Birim için 1 mL getirmek için ek TE ekleyin. Çözüm vortexing tarafından karıştırın. Litik enzim çözüm tüm 1 mL yıkanmış microgels en fazla 1 mL ekleyin. Tarafından Pipetting 10 x karıştırın. Karışım için 37 ° C’de kuluçkaya > (en fazla olduğu gecede kuluçka) bir shaker 2 h. 5. deterjan tabanlı Microgel tedavi Lizis litik enzimler (adım 4) üzerinden microgels yıkayın. Spin aşağı 2.000 x g 2 min için de microgels ve süpernatant Aspire edin. Damlacıkları Pelet içinde dağınık hücre artıkları nedeniyle opak beyaz görünür. Microgels 10 mM Tris-HCl tampon ve damlalıklı yukarı ve aşağı karıştırmak için 10 x 5 ml resuspend. Spin 2.000 x g 2 min için de aşağı karışımı, sonra süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. Deterjan bir tedavi microgels üzerinde gerçekleştirin. Bir lityum Lauryl Sülfat (kapakları) lizis arabellekte jelleri resuspend (% 0,5 w/v kapakları 20 mM Tris-HCl) ve son hacmiyle 3 mL 0.5 M EDTA 60 µL. 5 µL İndinavir K enzim (800 U/mL stok) ekleyin. Damlalıklı 10 x karıştırmak için yukarı ve aşağı sonra 42 ° C hücre zarları solubilize ve proteinleri sindirmek 1 h için ısı blokta karisimin kuluçkaya. Deterjan tedavi microgels yıkayın. Konik tüp microgels ile 2.000 x g 2 dk. çıkarmak için de süpernatant aspirasyon tarafından spin aşağı. Microgels 10 mL % 2 v/v polysorbate 20 dakika sonra su ile yıkayın. Damlalıklı karıştırmak için 10 x yukarı ve aşağı. Spin 2.000 x g 2 min için de aşağı konik Tüp, sonra süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. Microgels 10 mL % 100 etanol herhangi bir kalıntı enzim devre dışı bırakma ile yıkayın. Damlalıklı karıştırmak için 10 x yukarı ve aşağı. Spin 2.000 x g 2 min için de aşağı konik Tüp, sonra süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. Microgels 10 mL % 0.02 v/v polysorbate 20 dakika sonra su ile yıkayın. Damlalıklı karıştırmak için 10 x yukarı ve aşağı. Spin 2.000 x g 2 min için de aşağı konik Tüp, sonra süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. Tekrar polysorbate 20 3 x yıkayın. Çözüm bir 100 µm hücre süzgeç herhangi bir büyük kümeleri kaldırmak için son yıkama önce geçişi. Microgels 5 mL DNA yıkımı önlemek için 10 mM Tris-HCl tampon resuspend. Microgels 1 hafta önce (7. adım) tagmentation 4 ° C’de depolanmış olabilir. 6. barkod damlacıkları dijital PCR tarafından oluşturuluyor Astar (Tablo 2) BAR bir 500-pM hazır bir 1 x TE arabellekte bir düşük-bind Tüp hazırlayın. Her kullanımdan önce 1 de bir çalışma hazır astar sulandırmak ve 70 ° c ısı blokta 1 dk. için ısı. 75 bir 150-µL PCR reaksiyon karışımının hazırlamak µL yüksek sadakat sıcak başlangıç Master mix ( Tablo malzemelerigörmek) (2 x), 42 µL PCR-grade su, 3 µL DNA_BAR astar (10 µM hisse senedi, 0.2 µM son), P7_BAR astar (10 µM stok 3 µL 0.2 µM son), barkod seyreltme (1 de hisse senedi, 40 fM son) 6 µL, polysorbate 20, 6 µL (% 50 v/v hisse senedi, % 2 son) ve 15 µL 6 k (% 50 w/v hisse senedi, % 5 final), PEG. Yukarı ve aşağı 10 x pipetting karıştırın. HFE destekli bir şırınga HFE 200 µL çizerek yağ bir şırınga hazırlamak ve bir iğne ile uygun. PE boru bir bölümünü iğneye takın ve satırı el ile Başbakan. PE boru sonu hedef çözüm yerleştirin ve dikkatle tüm 150 µL PCR karışımı içine belgili tanımlık PE boru ve şırınga çizin. Şırınga bir şırınga pompa yükleyin. Bir % 2 w/w perfluoropolyether-Polietilen glikol (PFPE-PEG) yüzey aktif içeren 1 mL şırınga flüorlu yağ (HFE) ile yük, bir iğne ile uygun ve bir şırınga pompa yerleştirin. İş akışı dropmaking aygıtı kullanarak 25 µm barkod damla oluşturmak.Not: Bir aygıt için reaktif giriş ve çıkış konumunu gösteren şematik Şekil 3A bakın. Kurşun lehim küçük bir parça ile bir iş akışı dropmaker cihazın hücreleri giriş takın. HFE ile yüklenen şırınga bağlanmak ve PCR karışımı PE boru, parçaları kullanarak mikrosıvısal aygıt giriş Erimiş özel giriş için barkod kullanarak PCR karışımı. Tüpler cihazın içine eklemeden önce hava satırından kaldırmak için pompalar Başbakan. Boru parçası prizine takýn ve ücretsiz sonuna bir 0.2 mL PCR tüpü yerleştirin. Dropmaking için aşağıdaki (önerilen) akış oranları kullanın: 600 µL/h HFE % 2 w/w PFPE-PEG ve PCR karışımı için 200 µL/h için. Damla damla her tüpün içinde yaklaşık 50 µL PCR tüplerini içine toplamak. Dropmaking sonra dikkatlice HFE petrol alt tabakası jel-yükleme damlalıklı ipuçlarını kullanarak emülsiyonlar kaldırın ve % 5 w/w PFPE-PEG yüzey aktif içeren FC-40 flüorlu yağı ile değiştirin. Aşağıdaki iletişim kuralı ile termal döngüsü: 3 dk 98 ° C, 40 x / (98 ° C 10 s, 62 ° C 20 s, 72 ° C 20 s), 5 min ve o zaman tutun 12 ° C’de 72 ° CNot: Termal sağlanıncaya damlacıkları 1 gün için 4 ° C’de depolanmış olabilir. Barkod amplifikasyon ve encapsulation oranı doğrulayın. 1 x nükleik asit hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) içinde HFE leke bir % 2 w/w PFPE-PEG yüzey aktif ile; leke HFE marjinal karışan ve damlacıkları DNA’da bağlayacaksınız. Barkod termal sağlanıncaya emülsiyon 1 µL boyama petrol 10 µL için ekleyin. Onları oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Damlacıkları Floresan Mikroskobu (GFP kanal, 497/520 nm uyarma/emisyon dalga boyları) 200 X büyütme oranında görüntü ve barkod kapsülleme oranı say. Sinyal-ecek var olmak ayrı Not: boş damla karanlık görünür, ancak yükseltilmiş Bar kodları içeren damlacıklar parlak, belli (Şekil 4B). 7. Tagmentation damlacıkları olarak genomik DNA’ın Not: Şekil 2Bbakın. Bir nesil sıralama kitaplığı hazırlık üzerinden reaktifler kullanarak tagmentation solüsyonu 500 µL hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Tagmentation enzim 7 µL, tagmentation arabelleği 250 µL ve 243 µL PCR-grade su kullanın. Vortexing tarafından mix ve karışım spin aşağı toplamak için. Bu çözüm bir HFE petrol destekli 1 mL şırınga yük ve bir iğne ile uygun. Microgels reinjection için hazır olun. Spin aşağı 2.000 x g de 2 dk microgel tüp ve süpernatant Aspire edin. Küçük bir parça bant ile meme mühür ve jelleri 200 µL jel-yükleme damlalıklı bahşiş HFE destekli bir şırınga üst transfer. Bir 3D baskılı santrifüj bağdaştırıcı ile (bkz. ek dosyaları 1 ve 2), 3 dk 3000 x g az microgel şırınga spin. Sıvı süpernatant jel-yükleme damlalıklı ucu kullanarak şırıngadan çıkarın. Microgel katman şırınga meme tabanına itin. Şırınga bir iğne ile uygun. Bir % 2 w/w perfluoropolyether-Polietilen glikol (PFPE-PEG) yüzey aktif içeren bir 3 mL şırınga flüorlu petrol (HFE) yük, bir iğne ile uygun ve bir şırınga pompa yerleştirin. Microgels yeniden tagmentation reaktifler içeren damlacıklar saklanması.Not: Bir aygıt için reaktif giriş ve çıkış konumunu gösteren şematik Şekil 3B bakın. HFE, tagmentation mix ve microgels PE boru parçaları kullanarak mikrosıvısal aygıt alıcılar için içeren şırıngalar bağlayın. Tüpler cihazın içine eklemeden önce hava satırından kaldırmak için pompalar Başbakan. Boru parçası prizine takýn ve 1 mL hattına çizilmiş pistonu ile boş bir 1-mL şırıngada ücretsiz sonuna yerleştirin. Dropmaking için aşağıdaki (önerilen) akış oranları kullanın: 2.000 µL/h HFE % 2 w/w PFPE-PEG, 200 µL/h için microgels ve 500 µL/h tagmentation karışımı için. Microgel sarma hızı 400 X büyütme, hafif bir mikroskop altında doğrulayın. Yaklaşık 80- damla Şekil 4 ciçinde gösterildiği gibi bir microgel içermelidir. Bir iğne ile tagmentation emülsiyonlar içeren şırınga uygun ve dik bir ısı blok veya fırın 1 h 55 ° C’de genomik DNA parçalara ayırması için kuluçkaya. 8. tek hücreli barkodlama mikrosıvısal çift birleşme tarafından Not: Resim 2Cbakın. Barkod damlacıkları HFE % 2 w/w PFPE-PEG ile FC-40 yağ kesir değiştirerek birleşme için hazır olun. Dikkatle bu damla 1 mL şırınga aktarmak, bir iğne ile uygun ve bir şırınga pompa yerleştirin. İnkübe ve tagmented microgel damlacık şırınga bir şırınga pompa yükleyin. 500 µL PCR karışımı hazırlayın. Aşağıdaki sırada precipitates önleyebilirsiniz reaktifleri ekleyin: 140 µL PCR-grade su, 10 µL P5_DNA astar (10 µM hisse senedi, 0.2 µM son), 10 µL P7_BAR astar (10 µM hisse senedi, 0.2 µM son), 50 µL 6k (% 50 w/v stok PEG, % 5 final), polysorbate 20 (% 50 v/v hisse senedi, % 5 final) 50 µL, 250 µL Taq Master Mix (2 x) (bkz. Tablo malzemeler), izotermal polimeraz 10 µL (bkz. Tablo reçetesi) ve nötralizasyon arabelleği 10 µL ( Tablo malzemelerigörmek). Onları yukarı ve aşağı 10 x pipetting tarafından mix ve karışım spin aşağı onu toplamak için. Bu çözüm HFE destekli 1 mL şırınga yük, bir iğne ile uygun ve bir şırınga pompa yerleştirin. İçeren yük üç 3mL şırınga flüorlu yağ (HFE) ile bir % 2 w/w perfluoropolyether-Polietilen glikol (PFPE-PEG) yüzey aktif her bir iğne ile uygun ve şırınga pompa koyun. Üç 1 mL şırınga 2 M NaCl ile yük, her bir iğne ile uygun ve onları bir kenara koyun. Barkod damlacıkları, tagmented genom damlacıkları, birleştirme ve PCR karışımı Çift Kişilik birleşme aygıtı kullanarak.Not: Bir aygıt için reaktif ve elektrot giriş ve çıkış konumunu gösteren şematik bkz Şekil 5 . 3 NaCl şırınga 2 elektrot giriş ve tek hendek inletusing PE boru parçaları bağlayın. Elektrotlar için basınç için şırınga elektrotlar tamamen tuz solüsyonu ile doldurulur kadar el ile uygulayın. Hendek doldurulana kadar elektrotlar doldurduktan sonra hendek şırınga el ile basınç uygulayın. Kurşun lehim küçük bir parça ile hendek ücretsiz ucunu takın. 2 yer Açıcı yağ alıcılar ve dropmaking yağ inletusing parçalarını PE boru pompalar monte 3 HFE şırıngaları bağlayın. Tüpler cihazın içine eklemeden önce hava satırından kaldırmak için pompalar Başbakan. PCR karışımı şırınga bağlanmak microgel şırınga düşer ve barkod şırınga PE boru kullanarak onların anılan sıraya göre alıcılar için bırakır. Onları şırınga iğneleri için bağlanmadan önce tüm damlacık reinjection boru statik olmayan bir silahla ateş; statik olmayan tedavi damlacık birleştirme PE boru üzerinde statik yükleri çarpması riskini azaltır. PE boru parçası prizine takýn ve ücretsiz sonuna bir 0.2 mL PCR tüpü yerleştirin. Elektrot şırınga iğne bir soğuk katot floresan inverter bir timsah klip kullanarak bağlayın. İnverter’ın DC güç kaynağı V 2 olarak ayarlayın. Çift Kişilik birleşme aygıt önerilen akış oranları ile çalıştırın: tagmented microgel damla için 300 µL/s, 100 µL/h için barkod damla, 1500 µL/h HFE % 2 w/w PFPE-PEG (dropmaking yağı), 600 µL/h amplifikasyon için karıştırın, HFE % 2 w/w PFPE-PEG (200 µL/h Barkod spacer yağı) ve 700 µL/h HFE % 2 w/w PFPE-PEG (microgel spacer yağı). Damla ile emülsiyon her tüpün içinde yaklaşık 50 µL PCR tüpleri içine toplamak. Termal Bisiklete binme önce dikkatle HFE petrol alt tabakası jel-yükleme damlalıklı ipuçlarını kullanarak emülsiyonlar kaldırın ve onları bir % 5 w/w PFPE-PEG yüzey aktif içeren FC-40 flüorlu yağı ile değiştirin. Aşağıdaki iletişim kuralı ile termal döngüsü: 5 dk, 95 ° C için 2 dk, 30 x 65 ° C (95 ° C 15 s, 60 ° C için 1 dakika, 1 dk 72 ° C), 72 ° C 5 dk, sonra 12 ° C’de tutmak için Barkodlu DNA termal sağlanıncaya damlacıkları kurtarmak. Damlacıkları microcentrifuge tüpüne havuz ve 20 µL PFO kullanarak emülsiyonlar kesin. Girdap 10 için onları karıştırmak için s. Tüp 10.000 x g sulu (üst) ve petrol (alt) aşamaları karışımı fractionate için 1 dakika için de spin. Dikkatle ve yeni bir microcentrifuge tüp transfer üst sulu katman bir damlalıklı kullanarak tüm tüpünden çıkarın. Petrol faz atmak. Barkodlu PCR ürünü üreticinin protokolüne göre bir spin sütundaki arındırmak ve 1 x TE arabellek 20 µL içinde elute. Gerçekleştirilen sıralama ve çözümleme adımları 9 ve 10 göre devam edin. 9. Kütüphane hazırlık ve sıralama Tek hücreli Kütüphane parça boyutu-seçim ve miktar için üreticinin iletişim kuralları izleyerek nasıl yapılacağını için hazır olun. Varsayılan Kimya eşleştirilmiş uç kitaplıkla oku 1 ve okuma 2 için sıra. Özel dizin 1 astar I7_READ kullanın (Tablo 2) bir 15-bp Dizin okumak, tek hücreli Barkod olarak karşılık gelen için. 10. tek hücreli veri analizi Not: Kalite kontrol ve SiC-seq veri ön analizi için özel Python komut dosyaları-ebilmek var olmak downloaded–dan https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq. “BarcodeCleanup.py” kalite kontrol barkodlu okuma üzerinde gerçekleştirmek ve tek hücre veri bir SQLite veritabanına vermek için komut dosyasını çalıştırın. Bir denetim deneme için bu programı ile kullanmak “-Hizala” bayrak kümesi okuma için bilinen başvuru genleri hizalamak için. “Purity.py” komut dosyası kullanarak saflık (için bir denetim deney) Barkod grupların analiz ve yüksek saflıkta değerleri Şekil 6Bile tutarlı onaylayın.

Representative Results

SIC seq deneysel iş akışı bir yumuşak litografi yordam (Şekil 1) kullanarak fabrikasyon 3 PDMS mikrosıvısal cihazları içerir. Bir iş akışı dropmaker (Şekil 3A) 25 µm benzersiz bir tek hücreli tanımlayıcı genomik DNA etiketleme için dijital barkod damlacıkları oluşturur. Barkod oligonucleotides PCR güçlendirme (Tablo 2, BAR astar) için kolları tarafından çevrili bir 15 bp dejenere sırasında oluşur. Barkodlar tek molekül kapsülleme elde etmek için bir femtomolar konsantrasyon seyreltilmiş ve bütün damlacıklar ya 0 ya da 1 barkod fragment(s) alırsınız. Bir barkod içeren damlacıklar, Çift iplikçikli barkod amplicons çok sayıda kopyasını verimli güçlendirilmiş. Nükleik asit leke başarılı amplifikasyon doğrulamak ve barkod parçaları (Şekil 4B) kapsülleme oranını ölçmek için kullanılır. Microgels bir bakteri hücre süspansiyon ve erimiş özel jel eşit akış oranları (Şekil 2A), ortak akan tarafından oluşturulur. İş akış dropmaking süreci etkili sulu çözümler 2 katına sulandırır. gibi özel iki kez istenen son konsantrasyonu, hazırlanır. Özel soğudukça damlacığı küresel hacminin işgal 25 µm çapı microgel katılaşır. Yıkama ve lizis adımlar bir dizi yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA’microgels (Şekil 2B) arındırır. Emülsiyonlar kırdıktan sonra sulu yıkama geniş hacimli izleme aşağı akım enzimatik tedavi inhibe olabilir organik çözücüler sulandırmak için yapılmaktadır. Yıkanmış microgels hücre sarma hızı (Şekil 4A) doğrulamak için mikroskop altında gözlenir. Bir kokteyl enzim geniş litik aktivite ile bakteri ve ökaryotik mikroplar19hücre duvarlarını sindirmek için microgel süspansiyon eklenir. İndinavir K ve deterjan ile ikinci bir tedavi proteinler düşürür ve hücre artıkları solubilizes. Tagmentation saf DNA’ın küçük tagmented DNA parçalarının microgels18arasında difüzyon kaynaklanan potansiyel çapraz bulaşma kaçınmak için damlacıkları gerçekleştirilir. Bir damlacık saklama aygıtı (Şekil 3B) her microgel aynı anda aynı zamanda “o ile önceden yüklenmiş oligonükleotid20etiketleme ise” çift iplikçikli DNA parçaları bir tampon ve tagmentation enzim ile compartmentalizes. Microgels 1 microgel için her damla birkaç birini21 (Şekil 4 c) ile yaklaşan kapsülleme oranları elde parçacıkları, yakın Paketli olarak damlacıkları yüklenir. Mikrosıvısal iş akışı (Şekil 2C) son adımında bir aygıt 1 barkod damla, 1 damla microgel içeren ve kontrollü bir işlemdir amplifikasyon karışımda birleştiren bir çift birleşme işlemi gerçekleştirir. İlk olarak, PCR reaktif içeren bir damlacık eşleştirilmiş ve sarı (Şekil 5) gösterilen bölge bir barkod düşüş birleştirilir. Tuzlu su elektrotlar mikrosıvısal kanaldaki damlacık birleşme tetikler yüksek elektrik alanı degrade üretir. Benzer bir şekilde, ilk birleştirilmiş damlacık microgel damlacık ile eşleştirilmiş ve kırmızı ile gösterilen bölgede ikinci kez birleşti. Damlacıkları toplanır ve termal çip dışı bir tek-örtüşme uzantısında (SOE) PCR sağlanıncaya. Üst üste gelen tamamlayıcı biter barkod ve tagmented genomik DNA füzyon ve sadece doğru barkodlu yapıları, üstel amplifikasyon izin verir. Sıralama veri ilk okuma kalitesi ile filtre ve Okunma 15-bp tek hücreli barkod sırasına göre gruplandırarak ayrıştırılır. Barkod grubunda geçerli kabul edilmesi, okuma en az sayıda içermelidir; Bu eşik Analizi yararlı bir sıralama veri miktarı ile hücrelere sınırlar ve PCR mutasyona uğramış barkod “öksüz” kümesinden kaldırır. Çalıştırmak bu örnekte, Grup başına 7,5 kbps minimum ayarlanır (50 okuma 150 bp her). Bir çubuk grafik Grup boyutu karşı barkod sayar geçerli barkod grupları önemli bir bölümünü sadece eşik boyutunu (6A rakam) olduğunu gösterir. Denetim nerede mikrobiyal topluluk kompozisyon bilinmektedir deneyde, saflık ve göreli bereket ölçümleri SIC seq çalıştırmak kalitesini değerlendirmek için kullanılır. Burada, 3 gram-negatif bakteriler, 5 gram-pozitif bakteri ve 2 Mayalar içeren sentetik bir 10 hücreli topluluk analiz edilir. Verilen barkod grubunda saflığı en yaygın genom okuma grubunda toplam sayısı bölü grubunda Eşleme okuma sayısı olarak tanımlanır. Barkod gruplar büyük çoğunluğu eroine 0,95 (ekil 6B) büyük var. Hücre tiplerinin göreli bereket ham okuma sayma ve sayım grupları kendi üye okuma (Şekil 6C) uzlaşma için karşılık gelen bir hücre tipi nerede atanır barkod grupları tarafından hesaplanır. Okuma ve barkod grupları bolluk izlemek öyle ki bazı türler orantısız küçük veya büyük barkod gruplar halinde bulunmayan hücre popülasyonlarının örnek olduğunu belirten kabaca eşit oranlarda. Tek bir tür tüm barkod gruplarından toplam kapsama komplo yüksek kapsama az veya hiç çıkarma bölgesi (Şekil 7) içeren tüm genomu arasında gösterir. Kapsama tekdüzelik normalleştirilmiş kapsama değerleri, ortalama merkezli birçok değeri ile bir frekans dağılımı ile doğrulanabilir (Şekil 7, iç metin). Resim 1 : Fotolitografi tarafından mikrosıvısal cihazların imalat. (A)Master kalıpları tek özelliği yüksekliği ile SU-8 fotorezist silikon gofret üzerine bir tabaka kaplama spin tarafından imal edilmiştir. Fotorezist sonra photolithographic maskesi ve UV ışığı, crosslinking maruz kalan SU-8 ile desenli. Son olarak, uncrosslinked SU-8 bir geliştirici banyosunda feshedilmiştir. Elde edilen kalıp tam mikrosıvısal aygıt üretmek için cam slayda gümrüklü PDMS döküm için kullanılır. ()B) bir çift-tabaka aygıt için fabrikasyon benzer şekilde spin kaplama ve pozlama adımları ile başlar. Aşağıdaki adımları sonra bir iki katlı aygıt oluşturmak için yinelenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2: SIC seq iş akışı genel bakış. (A) A mikrobiyal süspansiyon erimiş özel microgels tek kişilik hücrelerde kapsüllemek için bir dropmaker cihaz ile birlikte akıyordu. (B) microgels yıkar bakteriyel genomik DNA arındırmak için bir dizi tabi tutulmaktadır. Litik enzimler gram-pozitif bakteri ve Maya hücre duvarlarını sindirmek ve deterjan hücresel enkaz solubilizes. Microgels yeniden damlacıkları çapraz bulaşma azaltmak tagmentation için içine saklanmış. (C) mikrosıvısal birleşme birleştirir dijital PCR barkod, tagmented microgel genom ve amplifikasyon karışımı bir hızda > 1 kHz. Çip dışı SOE-PCR tagmented genom üzerine benzersiz bir tek hücreli barkod tutturmak ve seçmeli olarak tamamen yükselterek barkodlu yapıları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: Mikrosıvısal cihazlar dropmaking ve microgel yeniden Kapsülleme için. (A) Bu panel bir iş akışı dropmaker (şekil yüksekliği 25 µm) gösterir. Hücreleri ve erimiş özel 25 µm x 25 µm merkezinde 25 µm damlacıkları üretmek için eşit akış oranları cihazın içine tanıtıldı. Dijital barkod dropmaking için hücre giriş takılı ve PCR karışımı özel giriş giriliyor. (B) Bu panel bir microgel yeniden saklama aygıtı (özelliği yüksekliği 25 µm) gösterir. Microgels içine onların yakın Paketli sipariş korumak ve bir tagmentation Mix 25 µm x 30 µm merkezinde yeniden kapsülleme önce alıyorsanız bir huni şeklinde giriş akışı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Filmler damlacıkları ve microgels. 25 µm microgels enzimatik lizis önce yıkanmış (A) Bu panel gösterir. Bakteri fluorescently kapsülleme oranı miktar için lekeli. Poisson yükleme istatistik hücreleri 1 10 damla bir hızda kapsüllü veya çoklu-kapsülleme olayları sıklığını en aza indirmek için daha az olmalıdır dikte. (B) Bu panel 25 µm dijital barkod damlacıkları ile bir nükleik asit leke tedavi floresans mikroskobu görüntüsünü gösterir. Güçlendirilmiş barkod parçaları içeren damlacıklar güçlü floresans sinyal üretirler. (C) Bu panel 50 µm damla yeniden kapsüllü microgels gösterir. Kapat-ambalaj microgels damla başına 1 jel kaç birini ile yaklaşan kapsülleme oranları sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : Mikrosıvısal Çift Kişilik birleşme aygıt için tek hücreli genom tedarikçidir. Bir iki adım birleşme işlemi barkod damlacıkları ile yüksek işlem hacmi itibariyle tagmented genleri çiftleri. Bir damlacık PCR karışımı ilk oluşturulan ve barkod damlacık tuzlu su elektrotları kullanarak sarı renkle gösterilen bölge içinde birleştirilir. Daha sonra bir microgel içeren bir damlacık tanıttı ve kırmızı ile gösterilen bölgede ikinci kez birleşti. Yağ giriş reinjected damlacıkları arasındaki boşluğu hassas kontrol sağlar. Barkod reinjection odası ve spacer petrol mavi gölgeli kısa 25 µm tabaka yerleştirilir. Diğer tüm aygıt özellikleri toplam yüksekliği 45 µm ile kalın katmana ait. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6 : Barkod grup ölçümleri 10 hücreli sentetik mikrobiyal topluluğunun. (A) Bu panel grubu boyutları barkod dağılımı gösterir. Grup bir boyut sayısı katlanarak grup büyüklüğü arttıkça azalır. Grup başına 7,5 kbps minimum eşik analizi bilgi yeterli miktarda sahip gruplara sınırlar ve PCR mutasyona uğramış sıra “yetimler.” kaldırır (B) Bu panel grup eroine barkod dağılımını gösterir. Büyük çoğunluğu (> % 90) gruplarıdır çok yüksek saflık (> % 95). (C) Bu panel 10 tür okuma ve barkod grubu düzeyinde hesaplanan göreli bolluk gösterir. Sayım yöntemleri 2 Barkod Grup boyutu türler arasında tutarlı hale gelir gösteren benzer sonuçlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 7 : Toplamak genomik kapsama Bacillus subtilis barkod gruplar. Bakteri B. subtilis için eşleme tüm barkod gruplardan okuma (N = 9,398) havuzlu ve toplam olarak analiz edilebilir. Dairesel kapsama alanı Haritası SIC seq okuma hiçbir gözlemlenebilir çıkarma bölgeler ile kapsama tekdüzelik göstermektedir. Kesikli çizgi çevresi ortalama kapsamı gösterir (5,55 x). Bir toplu üsleri genom genelindeki ortalama yakınındaki bir derinlikte kaplıdır göreli kapsama frekansları iç metin histogramını gösterir kesikli çizgiyle temsil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Aygıt 1 katman yüksekliği (µm) 1 katman Spin hızı (devir/dakika) 2 katman yüksekliği (µm) 2 katman Spin hızı (devir/dakika) İş akışı dropmaker 25 4000 N/A N/A Jel yeniden encapsulator 25 4000 N/A N/A Çift Kişilik birleşme 25 4000 20 5000 Tablo 1: mikrosıvısal cihaz üretim parametreleri. Bu tablo (SU-8 3025 için üreticinin belirtimlerine bağlı olarak) kaplama fotorezist spin için gerekli kendi hızlarında SIC seq akışında kullanılan mikrosıvısal aygıtlar listesini gösterir. Etiket Sıra (5′ > 3′) BAR GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT DNA_BAR CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA P7_BAR CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG P5_DNA AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC I7_READ GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA Tablo 2: Astar diziler. Ek dosya 1: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. Ek dosya 2: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

SIC seq mikrosıvısal iş akışı binlerce bakteri hücreleri tek hücre genomu sıralama veri üretir. Dijital barkod microgel kapsüllenmiş hücrelerin genleri spliced NGS veri silico deconvolution içine aynı hücreden kaynaklanan barkodlu okuma grupları için izin verir. Bilinen bileşimi gibi bir mikrobiyal topluluğu ile bir denetim deneme barkod grupları saflığı değerlendirmek için gereklidir. Yüksek saflıkta gruplar büyük bir kısmı hücre sarma hızı çok yüksekse veya önemli damlacık çapraz bulaşma mikrosıvısal işlem adımları sırasında meydana gelen gösterir. Poisson istatistiklere göre barkod ve hücreleri 1 parçacık oranı tüm boş olmayan damlacıklar % 5’den az birden fazla kapsülleme olayların sınırlamak her 10 damla için hedef oranında kapsüllü. Kapsülleme oranı doğrulama dropmaking işlemi sırasında kritik önemini bu yüzden bundan daha yüksek bir kapsülleme oranı katlanarak, birini oranda artırır. Farklı hücrelerdeki aynı barkod sıra paylaşımı okuma bioinformatically ayrılmış olamaz, çünkü kullanıcılar birden çok hücreyi tek bir microgel kapsüllemenin özellikle dikkatli olmanız gerekir. Durumda 1 hücre 2 farklı barkod alır, bereket ölçümleri barkod sırası tarafından sayarken etkiye sahip olsa da barkod grup saflık etkilenmez.

Damlacık çapraz bulaşma da suboptimal birleşme koşulları nedeniyle ortaya çıkabilir. Başarılı bir operasyon sırasında mikrosıvısal birleşme aygıt (Şekil 5) controllably 1 microgel ile 1 barkod damlacık ve PCR reaktif hacmi eşleştirebilirsiniz. Sigara-mükemmel akış oranları yanlış oranlarıyla eşleştirme damlacık neden olacaktır: 1 barkod 2 microgels ile örneğin eşleştirilmiş. Protokol listelenen tüm akış oranları tahminleri olması amaçlanmıştır ve aygıt geometri ve damlacık boyutlarda küçük farklılıklar bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Fotoğraf makinesi ile yüksek hızlı kayıt yeteneklere erişimi olan kullanıcılar (> 10.000 kare/s) doğru damlacık birleşme başında ve mikrosıvısal işlemi boyunca doğrulamanız gerekir. Bir yüksek hızlı kamera erişimi olmayan kullanıcılar birleştirilmiş çıktı küçük bir hacim toplamak ve el ile mikroskop altında damlacık boyutları ölçmek. Damlacık boyutu düzgün olmalıdır: reinjection gore buna göre azaltılacak birleştirilmemiş barkodlar veya microgel damla bir fazlalığı gösterir.

Kendi bütünlüğünü korumak için microgels ve microdroplets ele alırken birkaç genel önlemler alınmalıdır. Microgels, mekanik olarak sağlam olsa da, yeterince kırma ve tam jelleşme sağlamak için gereken adımları yıkama önce soğutmalı gerekir. Sigara küresel microgels özel değildi bir gösterge vardır kuvvetlendirmek için yeterli zaman verilirse. Microgels yıkarken, süspansiyonlar ürün kayıplarını önlemek için gerekli hızlarda spin aşağı. Özel hidrojel su yakından eşleşen bir kırılma indisi vardır ve kullanıcılar dikkatli aspirasyon öncesinde jel sıvı sınır belirlemek gerekir bu yüzden tüp22içinde görmek zor olabilir. Petrol su damlacıkları birleştirme tarafından statik kuvvetleri23 laboratuvar eldiven ve boru birikmesi yatkındır. Bu nedenle, damlacık reinjection şırınga çıplak elle yükleme ve pompa priming önce bir anti-statik silahla reinjection çizgilerin tedavisinde önerilir. Büyük birleştiler damlacıkları yavaş yavaş şırınga emülsiyonlar döner ve el ile onların büyük batmaz kuvvet nedeniyle üst biriktikçe daha büyük damla aspirating tarafından kaldırılabilir.

SiC-seq olduğunu, tek hücreli genom sıralama göstermek için ilk teknoloji > 50.000 bakteri hücreleri. Bu platform varolan yaklaşımlar içinde üretilen iş önemli avantaj sunar ve türdeş olmayan mikrobiyal topluluklar daha derin bir örnekleme sağlar. Bugüne kadar mikrosıvısal teknolojileri tek hücreli genom sıralama için microchambers9 ve microwells24 hücre izolasyon ve güçlendirme için ama sadece onlarca yüzlerce hücre aralığındaki throughputs ile istihdam. Akış tek hücreleri wellplates5,6 ‘ sıralama hiçbir özel mikrosıvısal araçları gerektirir ama aynı şekilde düşük bir üretilen iş sahip. Verilen bu çevreden toprak ve su örnekleri sık, Alfa farklılıkların var > 1.000 türler, seviye25,26, SIC seq organizmalar çok daha fazla sayıda örnek için onun yetenek sayesinde son derece avantajlı. SIC seq iş akışı laboratuvar kültür, doğal çevre, ya da bir yaşam ana hücre girişleri için uyarlanabilir kaynaklanıyor. Bir hücre örneği yalnızca bir sulu süspansiyon olması ve büyük parçacıkların ücretsiz (> 10 µm) uygun mikrosıvısal Kapsülleme için olmak. Örneğin, yöntem bir örnek yıkama bir dizi kullanarak ve hücreleri kapsülleme17önce ön işlemden için adımları filtreleme deniz suyu daha önce uygulandı.

SIC seq Protokolü nispeten seyrek bir sıralama veri miktarı her tek hücreden oluşturur ve tüm uygulamalar için uygun olmayabilir. Arama bazı Biyoinformatik algoritmaları de novo genom derleme veya tek nükleotid varyant (SNV) gibi verimli çalışması için daha yüksek kapsama derinlikleri gerektirir. Bunun yerine, böylece algoritmalar okuma büyük kümeleri üzerinde uygulanabilir barkod grupları kümelenmiş silico taksonomik binning yöntemleri27 tarafından olabilir. Nispeten düşük tüm tedarikçilerden etkinliğini SIC seq iş akışının da giriş örnek durumu düşük nerede durumlarda zorluklar takdim edebilir miyim? SiC-seq bir Poisson dağıtılmış barkod kapsülleme basamakta dayanır, bu nedenle hücreleri yaklaşık yüzde 10’u moleküler bir barkod almak ve son Kütüphane hazırlık adımı sırasında güçlendirilmiş. Bu diğer tedarikçilerden microdroplet tabanlı düzenleri10‘ a benzer olmakla birlikte, değerli hücre örnekleri ile çalışan kullanıcılar sıralama için yeterli kitaplığı verimi elde zorluk olabilir ve PCR döngüleri son sayısını artırmak gerekebilir amplifikasyon adım. Başka bir potansiyel kullanıcıları için mikrosıvısal uzmanlığı ile böylece genel barkodlama verimlilik getiren dijital PCR adım sonra olumlu barkod damlacıkları sıralamak için çözümdür > % 8528.

Bir potansiyel gelecekteki yönünü SIC seq teknolojisi için iş akışı yeni klinik tek hücre çalışmaları için önünü memeli hücreleri ile kullanmak için adapte olduğunu. Örnek olarak, kopya numarası varyasyon tek kanser arasında bir analizini hücreleri Mayıs heterojenite kanser patoloji2‘ deki rolü bizim anlayış daha fazla. Alternatif olarak, SIC seq yoklama ve DNA dizileri faiz29 zenginleştirmek için mevcut yöntemler ile entegre altgrupları hedeflenen tek hücreli sıralama veya hücrelerin nadir suşları sağlayacak. Çevre örnekleri ile bilinen bir metabolik yolu üzerinden genlerde hedef olabilir ve Roman genomik Adaları tanımlamak için genlerin komşu yanında içeriksel analiz. Gelen bir insan ana bilgisayar ortamında düşük-titresi patojen bakteri örnekleri izole olabilir ve daha fazla incelemek için tek hücre düzeyinde yakından virülans genotypic onların kökeni sıralı.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser bir kariyer Ödülü (grant numarası DBI-1253293); aracılığıyla Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (grant numaraları HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); ve Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı yaşayan dökümhaneler Program (sözleşme numaralarını HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materials

3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3025 photoresist Microchem 17030192
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Degassing chamber Bel-Art 42025
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
1 mL syringes BD 309628
27 gauge needles BD 305109
Syringe pump New Era Pump Systems NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE) 3M 98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
Space heater Lasko  CD09250 
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
TE (10X) Rockland mb-007
PBS 1X, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-65083
OptiPrep (density gradient medium) Sigma-Aldrich d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
Hexane Sigma-Aldrich 139386
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Lysozyme Type IV MP Biomedicals 195303
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme) Zymo Research e1004
Lysostaphin Sigma-Aldrich L7386
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
EDTA Sigma-Aldrich E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M Invitrogen 15567-027
Dithiothreitol (DTT) Teknova d9750
Lithium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L9781
Proteinase K New England Biosciences P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%) Koptec V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain) Invitrogen S7563
PEG 6k Sigma-Aldrich 81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Nextera DNA Library Prep Kit Illumina FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) New England Biosciences m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase) New England Biosciences m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer) Illumina FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter (custom) (custom)
DC power supply Mastech HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun Milty 5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research D4003
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  2. Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
  3. Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
  4. Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
  5. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
  6. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  7. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  8. Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
  9. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
  13. Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
  15. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784 (2016).
  16. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  17. Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
  18. Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
  19. Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
  20. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
  21. Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  22. Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).
  23. Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
  24. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  25. Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).
  26. Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
  27. Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
  28. Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).
  29. Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Tags

Single-cellGenome SequencingMicrofluidicsHigh-throughputBarcodingCell LysisAgaroseDroplet GenerationCell EncapsulationGenomic HeterogeneityCell SuspensionPBSSurfactantSyringe PumpTemperature ControlCollectionOil RemovalPFO

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Demaree, B., Weisgerber, D., Lan, F., Abate, A. R. An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (135), e57598, doi:10.3791/57598 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image