단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

1. 미세 장치 제조 준비는 미세 (제공 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용 하 여 마스크 디자인. DWG; 보조 파일참조). 인쇄 회로 기판 필름에 10 µ m 해상도와 공급 업체에서 이러한 디자인을가지고.참고: 다층된 미세 장치, 해당 마스크 포함 맞춤 표시. 각 장치에 대 한 수호-8 마스터 몰드 (그림 1A)를 다음과 같이 조작. 웨이퍼의 중심에 수 8 3025 감광 제의 약 1 mL을 붓는 의해 3에서 직경 실리콘 웨이퍼를 준비 합니다. 흡입을 적용 하 여 스핀 coater에 웨이퍼 척을 보안 합니다. 레이어 두께의 목록은 표 1 을 참조 하 고 각 장치에 대 한 속도 스핀. 모든 장치에 대 한 30 스핀 코팅을 시작 s 500 rpm에서 30 다음 표시 된 속도로 s. Spin coater를 30 분에 대 한 135 ° C로 설정 열판에 베이킹 후 실내 온도에 냉각 웨이퍼를 허용 하는 부드러운 빵 수호-8-실리콘 웨이퍼를 제거 합니다. 3 분에 대 한 조명을된 190 mW, 365 nm UV LED 아래 적절 한 미세 마스크 수-8-실리콘 웨이퍼를 노출 합니다. 노출, 하드 빵 열판에 웨이퍼 1 분 동안 135 ° C로 설정합니다. 이 베이킹 단계 실내 온도에 냉각 웨이퍼를 하실 수 있습니다. 단일 레이어 미세 장치 1.2.7 단계로 건너뜁니다. 다층된 미세 장치에 대 한 단계 1.2.1-감광 (그림 1B)의 두 번째 계층에 대 한 1.2.5 반복 합니다. 단일 계층 장치 (또는 다중된 장치에 대 한 두 번째 하드 빵)에 대 한 첫 번째 하드 빵, 다음 프로필 렌 글리콜 monomethyl 에테르 아세테이트 (PGMEA) 30 분의 욕조에 immersing 하 여 웨이퍼를 개발 합니다. 웨이퍼의 개발 후 웨이퍼 린스를 PGMEA를 포함 하는 물 총 병을 사용 합니다. 다음 물 총 병 135 ° C 열판 건조를 1 분 동안에 그것을 배치 하기 전에 소 프로 파 놀을 포함 하는 웨이퍼를 린스 합니다. (이제부터 마스터 라고 함) 웨이퍼 캐스팅입니다 (PDMS)와 페 트리 접시에 놓습니다. 마스터 단계 1.2 준비, PDMS 주조 장치 제조 수행 진행 합니다. PDMS 질량 11:1 비율에서 경화제와 실리콘 베이스를 결합 하 여 준비 합니다. 믹스 실리콘 베이스와 경화제 손으로 저 어 스틱. PDMS 생성 챔버에 배치 하는 진공을 적용 하 여 드. 공기 거품은 더 이상 표시 될 때까지 드를 PDMS를 허용 (일반적으로 30 분). 신중 하 게 최종 PDMS 층 두께 약 5 m m. 드가 모든 공기 거품의 제거를 보장 하기 위해 다시 PDMS 마스터 degassed PDMS 붓는 다. 기체 제거 후는 PDMS와 마스터 80 분 동안 80 ° C에서 구워. 신중 하 게 치료 PDMS 슬 래 브는 면도날을 사용 하 여 구운된 마스터에서 삭제할. 모든 상처는 실리콘 웨이퍼 위에 있는지 확인 하십시오.참고: 실리콘 웨이퍼에서 만든 상처는 균일 한 결합을 방지 하는 입술에 발생할 수 있습니다. 인 레트와 출구 0.75 m m 생 검 펀치를 사용 하 여 펀치. 모든 먼지와 길 잃은 PDMS 장치의 기능 측면에서 포장 테이프를 사용 하 여 제거 합니다. 플라즈마 장치 치료, 이전 소 프로 파 놀과 그것을 헹 구 고 그것을 건조 하 여 50 m m x 75 m m 유리 슬라이드를 청소. 플라즈마 처리에 대 한 위로 향하도록 기능 플라즈마 성으로 PDMS 슬 래 브와 유리 슬라이드를 놓습니다. 1 분 본드 유리에 장치 노출, 여 슬라이드 또는 얼굴, 함께 측 대 1 mbar O2 플라즈마를 사용 하 여 플라즈마 처리를 수행 합니다. 플라즈마 처리에 따라 40 분 동안 80 ° C에서 장치를 구워. 마지막으로, 소수 성 미세 채널을 렌더링 하는 후미의 하나로 유리 표면 처리 액체를 주사. 모든 채널 솔루션 완전히 침수 되 고 각 dropmaker에 대 한 주사를 반복 확인 하십시오. 80 ° c 10 분 초과 용 매를 증발 처리 장치를 구워. 2입니다. Agarose Microgels 세포의 캡슐화 참고: 그림 2A참조. 트리 스-EDTA (테) 버퍼 x 1에 3 %w / v 낮은 녹는 온도 agarose의 1 mL를 준비 합니다. Agarose 솔루션 로드 주사기 직전까지 90 ° C 열 블록에 계속. 세포 현 탁 액을 준비 합니다.참고:이 프로토콜과 관련 된 미세 장치는 검증 세균성 세포, 냉동된 주식 또는 신선한 준비 작업입니다. 포유류 세포, 세포 유형에 따라 미세 채널 차원의 더 큰 셀 크기에 맞게 조정을 해야 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL에 셀 resuspend hemocytometer 또는 흐름 정렬 셀을 계산 합니다. 1에서 10의 대상 셀 캡슐화 속도 25 µ m microgels에 대 한 107 셀/mL x 2.4의 최종 농도에 세포 현 탁 액 1 mL를 준비 합니다. 3 분 Aspirate는 상쾌한 3000 x g에서 셀 아래로 회전 하 고 17 %v / v 밀도 그라데이션 매체의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend ( 재료의 표참조) PBS에. 주사기 로드까지 얼음에 계속. 2 %w / w perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG PFPE) 계면 활성 제 포함 된 불 유 (HFE) 3 mL 주사기를 로드, 27 G 니 들 맞지 고 그것 주사기 펌프 합니다.이 프로토콜에는 미세에 27g 바늘으로 모든 주사기 단계: 맞는. 펌프 작업이 시작 될 때까지 실수로 찌르는의 위험을 줄이려면 모든 바늘에 모자를 유지. 1 mL 주사기로 세포 현 탁 액 및 녹은 agarose를 로드 하 고 27-게이지 바늘, 둘 다 맞는 주사기 펌프에 배치. Agarose 주사기와 펌프에서 주사기와 튜브 입구에 고는 agarose를 방지 하기 위해 작은 공간 히터와 따뜻한 유지. 높은 공간 히터를 설정 하 고 난방 표면은 주사기에서 약 10cm 위치. 주사기에 측정 온도 약 80 ° c. 인지 확인참고: 사용자는 튜브의 녹는 포함 하 여, 장비 손상의 위험을 줄이기 위해 펌핑 장치에서 권장된 거리에서 히터를 유지 하도록 조언 된다. 25 µ m microgel 방울 공동 흐름 dropmaking 장치를 사용 하 여 생성 합니다.참고: 장치 시 약 인 레트 및 출구의 위치를 나타내는 구조도 그림 3A 참조. 폴 리 에틸렌 (PE) 관의 조각을 사용 하 여 미세 장치 후미에 주사기 바늘을 연결 합니다. 장치에 튜브를 삽입 하기 전에 라인에서 공기를 제거 하는 펌프 프라임. 콘센트 배관의 일부를 연결 하 고 15 mL 컬렉션 튜브에서 무료 끝을 배치. Dropmaking에 대 한 다음 (권장된) 유량을 사용: HFE 2 %w / w PFPE-말뚝; 800 µ L/h PBS;에 세포 현 탁 액에 대 한 200 µ L/h 그리고 200 µ L/h 3 %w / v agarose. Dropmaking, 후는 agarose의 완전 한 겔 화 되도록 30 분 동안 4 ° C에서 컬렉션 튜브를 놓습니다. 3. 분리 및 세척 Agarose Microgels Agarose 방울의 상위 계층을 방해 하지 않도록 주의 복용 20 G 바늘 장착 3 mL 주사기를 사용 하 여 컬렉션 튜브에서 오일의 하위 계층을 제거 합니다. Perfluorooctanol (PFO)와 유화 제를 휴식. HFE에 agarose 방울 10 %v / v PFO의 1 mL를 추가 합니다. 피펫으로 철저 하 게 코트는 유화 액을 1 분 위로, 아래로이 솔루션.참고: 모든 microgel에 대 한 세척 단계, 피펫으로 1000 µ L 팁 솔루션. 균질 및 그것 pipetting 후 덩어리의 무료 microgel 정지 표시 되어야 합니다. 2000 x g 1 분 agarose microgels 수집에서 원뿔 튜브를 회전 합니다. PFO/HFE 상쾌한 포부;에 의해 제거 microgels 그들의 계면 층의 지금 자유롭다 고 분명 나타납니다. 헥 산에는 계면 활성 제와 microgels를 씻어.주의: 제 초 제는 휘발성 유기 용 매, 그리고 단계 3.3에서에서 세척 증기 두건에서 실시 한다. 1 %v / v sorbitan monooleate 비 계면 활성 제의 2 개 mL를 추가 ( 재료의 표참조) agarose microgels 헥 산에. 혼합 10 x 위아래로 피펫으로, 작은 microgel의 완전 한 결별을 보장. 1000 x g 1 분은 microgels 수집에서 튜브를 회전 합니다. 계면 활성 제/헥 산 솔루션을 제거 하려면 상쾌한 발음 계면 활성 제/헥 산 세척을 반복 합니다. 모든 잔류 유기 용 매를 제거 하는 수성 버퍼에서는 microgels를 씻어. TET 버퍼의 5 mL을 추가 [0.1 %v / v octylphenol ethoxylate 비 세제 ( 재료의 표참조)에 1 x 테] 원뿔 관에. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다. 2000 x g 2 분은 microgels 수집에서 원뿔 튜브를 회전 합니다. TET 버퍼를 제거 하는 상쾌한 발음 TET 세척 2 x를 반복 합니다. 원뿔 튜브에 1 x 테 버퍼의 5 mL를 추가 합니다. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다. 2000 x g 2 분은 microgels 수집에서 원뿔 튜브를 회전 합니다. TE 버퍼를 제거 하는 상쾌한 발음 테 세척을 반복 합니다. 10 µ L 약 수와 젤의 얼룩으로 400 X 확대 현미경 microgels에 셀 캡슐화 확인 1 x 핵 산 얼룩 ( 재료의 표참조).참고: Microgels 세포 DNA에서 GFP 채널 (497/520 nm 여기/방출 파장) 형광 것입니다 하는 동안 투명 한 채널에서 분명히 나타납니다. 그림 4A와 같이 투명 하 고 형광 채널의 오버레이 microgels 셀 표시 됩니다. 4. Agarose 용균성 효소를 통해 세포의 세포의 용 해 1 mL 용균성 효소 60mg lysozyme (동결 건조 된 분말), EDTA (0.5 M 재고의 15 µ L의 TE 버퍼 (1x), 효 모 용균성 효소 (5 U / µ L 주식, 최종 10 U/mL), dithiothreitol (1 M 주식, 최종 30 m m)의 30 µ L의 2 µ L의 800 µ L를 사용 하 여 칵테일의 준비 최종 7.5 m m), mutanolysin (100 U / µ L 주식, 최종 200 U/mL)의 2 µ L, 2 µ L의 lysostaphin (10 U / µ L 주식, 최종 20 U/mL), 그리고 30 µ L NaCl (1 M 주식, 최종 30 m m)의. 1 mL을 볼륨을가지고 추가적인 테를 추가 합니다. Vortexing에 의해 솔루션을 믹스. 씻어 microgels의 더 이상 1 ml 용균성 효소 솔루션의 전체 1 mL를 추가 합니다. Pipetting 10 x 믹스. 37 ° C에서 혼합물을 품 어 > (최대는 야간 보육) 통에 2 h. 5. 세제-기반 Microgel 치료 용균성 효소 (4 단계)을 통해 세포의 용 해, 다음은 microgels 세척. 2000 x g 2 분에서 microgels 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한 발음. 작은 물방울 불투명 화이트 셀 파편 펠 릿에 분산으로 인해 나타납니다. 10 mM Tris HCl 버퍼와 혼합 10 x 위아래로 피펫으로의 5 ml는 microgels resuspend. 2000 x g 2 분 대에서 혼합물 스핀 다운 다음 포부는 상쾌한 제거. microgels에 세제 처리를 수행 합니다. 리튬 라우릴 황산 (뚜껑) 세포의 용 해 버퍼에는 젤 resuspend (20 mM Tris HCl에에서 뚜껑 0.5 %w / v) 및 3 mL의 최종 볼륨을 0.5 M EDTA의 60 µ L. 가수분해 K 효소 (800 U/mL 주식)의 5 µ L를 추가 합니다. 혼합, 10 x 위아래로 피펫으로 다음 solubilize 세포 막 단백질을 소화 하는 1 시간에 대 한 열 블록에 42 ° C에 혼합물을 품 어. 세제 치료 다음에 microgels 세척. 스핀은 microgels와 원뿔 튜브 아래로 2000 x g 2 분 제거에는 상쾌한 포부에 의해. Microgels 2 %v / v 음식 물에 20의 10 mL로 씻는 다. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다. 2000 x g 2 분 동안에 아래로 원뿔 튜브를 회전 다음 흡 인 여는 상쾌한을 제거 합니다. 워시 모든 잔여 효소 비활성화를 100% 에탄올 10 mL와 함께 microgels. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다. 2000 x g 2 분 동안에 아래로 원뿔 튜브를 회전 다음 흡 인 여는 상쾌한을 제거 합니다. Microgels 0.02 %v / v 음식 물에 20의 10 mL로 씻는 다. 피펫으로 위아래를 섞어 10 배입니다. 2000 x g 2 분 동안에 아래로 원뿔 튜브를 회전 다음 흡 인 여는 상쾌한을 제거 합니다. 반복 20 음식을 씻어 3 배. 어떤 큰 덩어리를 제거 하는 마지막 세척 전에 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 솔루션을 전달 합니다. DNA 저하를 방지 하기 위해 10 mM Tris HCl 버퍼의 5 ml에서는 microgels resuspend. microgels tagmentation (7 단계) 이전까지 1 주에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 6. 디지털 PCR에 의해 작은 물방울 바코드 생성 TE 버퍼 낮은 바인딩 튜브에서 x 1에 뇌관 (표 2) 바의 500-오후 재고를 준비 합니다. 각각의 사용, 이전 작업 재고 1 오후의 뇌관을 희석 하 고 열 블록에 1 분 동안 70 ° C에가 열. 75를 사용 하 여 150 µ L PCR 반응 혼합 준비 충실도 높은 뜨거운 시작 마스터의 µ L 믹스 ( 재료의 표참조) (2 배), PCR 급 물, DNA_BAR 뇌관 (10 µ M 주식, 최종 0.2 µ M)의 3 µ L, P7_BAR 뇌관 (10 µ M 재고의 3 µ L의 42 µ L 최종 0.2 µ M), 바코드 희석 (1 오후 주식, 최종 40 fM)의 6 µ L, 6 µ L 폴 20의 (50 %v / v 재고, 2% 최종), 및 15 µ L 말뚝의 6 k (50 %w / v, 주식 5% 최종). 10 배 아래로 pipetting으로 혼합. 준비 HFE 백업 주사기 HFE의 200 µ L를 그려서 오일 주사기로 하 고 바늘으로 적합. 바늘을 PE 튜브의 섹션을 연결 하 고 라인을 손으로 총리. 대상 솔루션에 PE 튜브의 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 PE 튜브와 주사기에 PCR 혼합의 모든 150 µ L를 그립니다. 주사기 펌프에 주사기를 로드 합니다. 로드 불 오일 (HFE) 2 %w / w perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG PFPE) 계면 활성 제를 포함 하는 1 mL 주사기, 바늘, 그것을 맞는 고 그것 주사기 펌프 합니다. 25 µ m 바코드 상품 공동 흐름 dropmaking 장치를 사용 하 여 생성 합니다.참고: 장치 시 약 인 레트 및 출구의 위치를 나타내는 구조도 그림 3A 참조. 셀 입구 납 땜 납의 작은 조각으로 공동 흐름 dropmaker 장치를 연결 합니다. HFE와 함께 로드 된 주사기를 연결 하 고 PCR 혼합 PE 튜브의 조각을 사용 하 여 미세 장치 후미에 녹은 Agarose 입구를 사용 하 여 바코드에 대 한 PCR 혼합. 장치에 튜브를 삽입 하기 전에 라인에서 공기를 제거 하는 펌프 프라임. 콘센트 배관의 일부를 연결 하 고 0.2 mL PCR 튜브에 자유로운 끝을 배치. Dropmaking에 대 한 다음 (권장된) 유량을 사용: HFE 2 %w / w PFPE 말뚝 및 PCR 혼합에 대 한 200 µ L/h 600 µ L/h. 각 튜브의 상품의 약 50 µ L PCR 튜브를 수집 합니다. Dropmaking, 후 신중 하 게 젤 로드 피펫으로 팁을 사용 하 여 유화 액에서 HFE 오일의 더 낮은 층을 제거 하 고 5 %w / w PFPE 못 계면 활성 제를 포함 하는 FC-40 불 기름으로 그것을 대체 합니다. 다음 프로토콜 열 주기: 3 분 동안 98 ° C, 40 x (98 ° C 10 s, 20 62 ° C s, 20 72 ° C s), 72 ° C 5 분, 그리고 대기 12 ° c.에 대 한참고: 열 순환 방울 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 일. 바코드 증폭 및 캡슐화 속도 확인 합니다. 1 x 핵 산 준비는 2 %w / w PFPE 못 계면 활성 제;와 HFE에 ( 재료의 표참조)을 얼룩 얼룩 소폭 HFE에 혼합할 수 있는 이며 작은 물방울에서 DNA에 바인딩하는 것입니다. 얼룩 오일의 10 µ L를 열 순환 바코드 유제의 1 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 그들을 품 어. 200 배 확대에 형광 현미경 검사 법 (GFP 채널, 497/520 nm 여기/방출 파장) 물방울 이미지 및 바코드 캡슐화 속도. 신호 이산 됩니다: 빈 방울 어두운 나타납니다 반면 증폭 된 바코드를 포함 하는 작은 물방울 밝게, 형광 것 이다 (그림 4B). 7입니다. 작은 물방울에서 게놈 DNA의 Tagmentation 참고: 그림 2B참조. 다음-세대 시퀀싱 라이브러리 준비에서 시 약을 사용 하 여 tagmentation 솔루션의 500 µ L를 준비 키트 ( 재료의 표참조). 사용 하 여 tagmentation 효소의 7 µ L, tagmentation 버퍼의 250 µ L 및 243 µ L PCR 급 물. Vortexing에 의해 그들을 혼합 하 고 수집 하는 혼합물 아래로 회전. HFE 석유 지원 1 mL 주사기에이 솔루션을 로드 하 고 바늘으로 적합. microgels는 reinjection에 대 한 준비. 2000 x g에서 2 분 동안 microgel 튜브 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한 발음. 젤 로드 피펫으로 팁 HFE 백업 주사기의 상단에 젤의 200 µ L을 전송 하 고 테이프의 작은 조각으로 노즐을 봉인. 3D 인쇄 원심 분리기 어댑터를 사용 하 여 ( 추가 파일 1 과 2참조), 3000 x g에서 3 분 microgel 주사기를 스핀. 젤 로드 피펫으로 팁을 사용 하 여 주사기에서 액체 상쾌한을 제거 합니다. Microgel 레이어 주사기 노즐의 기지를 밀어. 주사기 바늘으로 적합. 로드 2 %w / w perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG PFPE) 계면 활성 제 포함 된 불 유 (HFE) 3 mL 주사기, 바늘, 그것을 맞지 고 그것 주사기 펌프 합니다. 다시 tagmentation 시 약을 포함 하는 작은 물방울으로는 microgels를 캡슐화 합니다.주: 장치 시 약 인 레트 및 출구의 위치를 나타내는 도식에 대 한 그림 3B 를 참조 하십시오. HFE, tagmentation 믹스, 그리고 microgels PE 튜브의 조각을 사용 하 여 미세 장치 후미에 주사기를 연결 합니다. 장치에 튜브를 삽입 하기 전에 라인에서 공기를 제거 하는 펌프 프라임. 콘센트 배관의 일부를 연결 하 고 1 mL 선으로 그려진 플런저와 빈 1 mL 주사기에 자유로운 끝을 배치. Dropmaking에 대 한 다음 (권장된) 유량을 사용: HFE 2 %w / w PFPE 못 2000 µ L/h, microgels를 위한 200 µ L/h 및 500 µ L/h tagmentation 믹스에 대 한. 400 배 확대에 가벼운 현미경 microgel 캡슐화 속도 확인 합니다. 그림 4C와 같이 방울의 약 80-90%는 microgel를 포함 해야 합니다. 주사기 바늘으로 tagmentation 유화 액을 포함 하 고 열 블록 또는 genomic DNA 조각에 55 ° C에서 1 시간 동안 오븐에서 직 립 품 어 있습니다. 8. 단일 셀 Barcoding 미세 이중 합병에 의해 참고: 그림 2C참조. HFE 2 %w / w PFPE 못 FC-40 오일 분수를 대체 하 여 합병을 위한 바코드 방울을 준비 합니다. 조심 스럽게이 액 1 mL 주사기로 전송, 바늘, 그것을 맞는 고 그것 주사기 펌프 합니다. 주사기 펌프를 incubated 및 tagmented microgel 방울 주사기를 로드 합니다. PCR 혼합의 500 µ L를 준비 합니다. 형성에서 침전을 방지 하기 위해 다음 순서로 시 약을 추가: PCR 급 물, P5_DNA 뇌관 (10 µ M 주식, 최종 0.2 µ M)의 10 µ L, P7_BAR 뇌관 (10 µ M 주식, 최종 0.2 µ M)의 10 µ L, 50 µ L 말뚝의 6 k (50 %w / v 주식 140 µ L 최종 5%), 폴 20 50 %v / v 재고, 5% (최종)의 50 µ L, Taq 마스터 믹스의 250 µ L (2 x) ( 재료의 표참조), 등온선 중 합 효소의 10 µ L ( 재료의 표참조), 그리고 중화 버퍼의 10 µ L ( 재료의 표참조). 10 x 위아래로 pipetting으로 그들을 혼합 하 고 그것을 수집 하는 혼합 아래로 회전. HFE 백업 1 mL 주사기에이 솔루션 로드, 바늘, 그것을 맞는 고 그것 주사기 펌프 합니다. 부하 세 3 mL 주사기 불 오일 (HFE) 포함 하는 2 %w / w perfluoropolyether-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG PFPE) 계면 활성 제, 바늘으로 각각에 맞는 고 그들 주사기 펌프 합니다. 2 M NaCl로 3 1 mL 주사기를 로드 하 고 각각의 바늘을 맞는 그들을 따로 설정. 병합 바코드 방울, tagmented 게놈 방울, 그리고 PCR 이중 합병 장치를 사용 하 여 혼합.주: 장치 시 약 및 전극 인 레트 및 출구의 위치를 나타내는 도식에 대 한 그림 5 를 참조 하십시오. 2 전극 후미와 PE 튜브의 자에 단일 inletusing 조각 3 NaCl 주사기를 연결 합니다. 전극, 적용 압력 주사기를 수동으로 전극 소금물으로 완전히 채워집니다 때까지. 작성 후 전극, 수동 압력 굴 주사기에 자에 채워질 때까지 적용 됩니다. 납 땜 납의 작은 조각으로 굴의 자유로운 끝을 연결 합니다. 3 HFE 주사기 펌프 2 스페이서 오일 후미와 PE 튜브의 dropmaking 기름 inletusing 조각에 연결 합니다. 장치에 튜브를 삽입 하기 전에 라인에서 공기를 제거 하는 펌프 프라임. PCR 혼합 주사기를 연결 하 고 microgel 주사기, 상품 바코드 상품 주사기 PE 튜브를 사용 하 여 그들의 각각 후미. 주사기 바늘;에 그들을 연결 하기 전에 정전기 방지 총으로 모든 방울 reinjection 튜브를 촬영 정전기 방지 치료 방울 접착 PE 배관에 정전기에 의해 유도 된의 위험을 줄여줍니다. PE 튜브의 조각을 콘센트에 연결 하 고 0.2 mL PCR 튜브에 자유로운 끝을 배치. 악어 클립을 사용 하 여 냉 음극 형광등 인버터에 전극 주사기의 바늘을 연결 합니다. 2 V 인버터의 DC 전원 공급 장치를 설정 합니다. 권장된 흐름 율을 가진 이중 합병 장치 실행: tagmented microgel 삭제에 대 한 300 µ L/h, 100 µ L/h 바코드 상품, HFE 2 %w / w PFPE-말뚝 (dropmaking 기름)에 대 한 1500 µ L/h, 확대를 위한 600 µ L/h에 대 한 혼합, HFE 2 %w / w PFPE 페그 (200 µ L/h 바코드 공백 기름), 700 µ L/h HFE 2 %w / w PFPE-말뚝 (microgel 스페이서 기름). 각 튜브에서 유제의 약 50 µ L PCR 튜브를 수집 합니다. 열 순환, 전에 신중 하 게 젤 로드 피펫으로 팁을 사용 하 여 유화 액에서 HFE 오일의 더 낮은 층을 제거 하 고 5 %w / w PFPE 못 계면 활성 제를 포함 하는 FC-40 불 기름으로 대체. 다음 프로토콜 열 주기: 5 분, 2 분 동안 95 ° C, 30 x 65 ° C (95 ° C 15에 대 한 s, 1 분, 1 분에 72 ° C를 위한 60 ° C), 72 ° C 5 분, 다음 12 ° c.에서 개최 열 순환 방울에서 바코드 DNA를 복구 합니다. Microcentrifuge 튜브에 방울 풀 고 PFO의 20 µ L를 사용 하 여 유화 액. 와 동 10 그들 혼합 s. 1 분 수성 (맨 위)과 기름 (아래) 단계에 혼합물을 충분치 10000 x g에서 튜브를 회전 합니다. 조심 스럽게를 피펫으로 사용 하 여 튜브에서 위 수성 층을 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송. 오일 단계를 삭제 합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 스핀 열에 바코드 PCR 제품을 정화 하 고 1 x 테 버퍼의 20 µ L에 elute. 단계 9 및 10에 의하여 분석 수행된 시퀀싱을 진행 합니다. 9. 라이브러리 준비 및 시퀀싱 조각 크기 선택 및 정량화에 대 한 제조 업체의 프로토콜에 따라 시퀀싱에 대 한 단일 셀 라이브러리를 준비 합니다. 읽기 1과 읽기 2 기본 화학 결합-엔드 라이브러리 시퀀스입니다. 사용자 정의 인덱스 1 뇌관 I7_READ를 사용 하 여 (표 2)에 해당 하는 단일 셀 바코드 읽기, 15-bp 인덱스에 대 한. 10. 단일 셀 데이터 분석 참고: 품질 관리 및 SiC seq 데이터의 예비 분석에 대 한 사용자 정의 파이썬 스크립트는 https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq에서 다운로드할 수 있습니다. “BarcodeCleanup.py” 바코드 읽기에서 품질 관리를 수행 하 고 단일 셀 데이터는 SQLite 데이터베이스를 내보낼에 스크립트를 실행. 제어 실험에 대 한이 스크립트를 사용 하 여는 “-정렬”로 알려진된 참조 게놈을 읽기 정렬 설정 플래그. “Purity.py” 스크립트를 사용 하 여 (제어 실험)에 대 한 바코드 그룹의 순도 분석 하 고 그림 6B와 고 순도 값을 확인 합니다.