Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar los folículos en los ovarios cultivados de ratones jóvenes sin seccionamiento serial. Con inmunofluorescencia de todo órgano y tejido claro, seccionar físico se sustituye por seccionamiento óptico. Este método de preparación de la muestra y visualización mantiene la integridad de órganos y facilita la cuantificación automática de células específicas.
Abstract
Investigación en el campo de la biología reproductiva de mamífero a menudo implica evaluar la salud general de los ovarios y los testículos. Específicamente, en las mujeres, fitness ovárico a menudo es evaluado por visualización y cuantificación de los folículos y ovocitos. Porque el ovario es un opaco tejido tridimensional, los enfoques tradicionales requieren laborioso cortar el tejido en numerosas secciones seriadas para poder visualizar las células en el órgano entero. Además, porque la cuantificación por este método típicamente conlleva puntuación sólo un subconjunto de las secciones separadas por el diámetro aproximado de un ovocito, es propensa a la inexactitud. Aquí, se describe un protocolo que utiliza en su lugar claro de tejido órgano entero y tinción de inmunofluorescencia de ovarios de ratón para visualizar los folículos y ovocitos. En comparación con los enfoques más tradicionales, este protocolo es ventajoso para la visualización de las células en el ovario por muchas razones: 1) el ovario se mantiene intacto a lo largo de la preparación de la muestra y el procesamiento; 2) ovarios pequeños, que son difíciles de sección, pueden examinarse con facilidad; 3) celular cuantificación se logra más fácilmente y con precisión; y 4) el órgano entero reflejado.
Introduction
Para estudiar la composición celular y las características morfológicas de los ovarios mamíferos, los científicos a menudo confían en vivo experimentos, seguidos por la coloración de immunohistological de los ovarios de embebido de parafina. Más recientemente sin embargo, cultura de órgano entero ovario ha demostrado para ser una alternativa eficaz para el estudio de la función ovárica1,2,3,4 porque la técnica puede combinarse con mejor visualización y herramientas de cuantificación. Tradicionalmente, el análisis de la morfología ovárica depende de reconstrucción tridimensional arquitectura ovárica de embebido de parafina secciones seriales, pero, además de ser laborioso y desperdiciador de tiempo, en serie Seccionando tejido embebido de parafina no garantía de reconstrucción adecuada del órgano y secciones a menudo se pierden o mal ordenadas en el proceso.
Además de los desafíos técnicos asociados con el seccionamiento serial, también hay variaciones en los métodos habitualmente utilizados para cuantificar el número de folículos por ovario de5,6. La variabilidad metodológica utilizada actualmente deteriora metanálisis de reserva ovárica a través de estudios5,7. Por ejemplo, números de folículos de diferentes artículos pueden variar en 10 veces o más entre las edades del desarrollo similares dentro de una cepa específica6. Estas grandes diferencias en la cuantificación reportados del folículo pueden conducir a la confusión y han obstaculizado las comparaciones Cruz-estudio. Experimentalmente, los enfoques tradicionales para cuantificación de folículo de secciones seriales realizan recuento de folículos de un número predefinido de secciones (por ejemplo, cada quinto, décimo, u otra sección). Variabilidad en folículo cuenta con este enfoque surge no sólo de la periodicidad en que secciones se cuentan sino también de las variaciones en el grosor de la sección y experiencia técnica en la generación de secciones seriadas de5,6. Además de su variabilidad, otra desventaja de seccionamiento de tejidos tradicionales es que el seccionamiento de ovarios pequeños de animales jóvenes es especialmente difícil y depende en gran medida de tejido orientación8.
El protocolo a continuación describe un ovario rutinariamente usada cultura técnica1 pero mejora grandemente sobre cuantificación de folículo tradicional mediante la sustitución física de seccionamiento con tejido claro y seccionamiento óptico usando microscopia confocal8 ,9. Mediante inmersión del tejido (sin la necesidad de perfusión de transcranial o electroforesis) en una urea y sorbitol basado en solución (por ejemplo, ScaleS(0)10) resultó compatible con la inmunotinción y permitió la reducción de tiempo de limpieza sin comprometer la profundidad de la proyección de imagen. Otros métodos reportados (p. ej., ScaleA28,10, SeeDB11, Clear12y ClearT212) están más tiempo consumiendo o no permite profundidad resolución óptica de la muestra. Seccionamiento óptico es ventajoso porque es menos mano de obra y mantiene arquitectura tridimensional7,8 el órgano. Otra ventaja de este enfoque es que la preparación de las muestras no requiere de costosos reactivos para eliminar el tejido y puede llevarse a cabo con relativa facilidad.
Específicamente, el protocolo descrito ha sido optimizado para los ovarios de ratón cultivadas en día postnatal cinco pero se ha realizado en los ovarios desde día postnatal 0 – 10. El método hace uso de un sistema de cultivo de ovario en el que el tejido naturalmente se une a la membrana en la que se cultiva, facilitando el manejo del órgano y manipulación. El sistema de cultivo descrito puede utilizarse para mantener explanted ovarios hasta por 10 días y evaluar cómo las diferentes condiciones experimentales pueden interferir con el oocyte supervivencia13. El procedimiento de cuantificación descrito se realiza utilizando el paquete ImageJ FIJI14 de procesamiento de imágenes no comerciales y puede llevarse a cabo en la mayoría de los ordenadores personales. Además, las imágenes utilizadas para la cuantificación es posible disponibles para la comunidad científica, permitiendo así futuros metanálisis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio de mamífero reproducción requiere utilizar y cuantificar las células especializadas que no son habitualmente susceptibles de cultivo celular. Sin embargo, sistemas de cultivo ex vivo son efectivos en mantener ovario folículo viabilidad1,15. Durante cultura de ovario, el tejido requiere una mayor superficie para el intercambio de nutrientes a través de la difusión. Por lo tanto, 5 – viejo ratón ovarios son ideales en tamaño y forma de c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Rebecca Williams y Johanna Dela Cruz de la imagen de BRC de Cornell y Andrew Recknagel para sugerencias y asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado a institutos nacionales de la subvención de salud S10-OD018516 (al centro de la proyección de imagen de Cornell), T32HD057854 a J.C.B. y R01-GM45415 a J.C.S.
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
Referências
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