Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников
Summary
Здесь мы представляем протокол для количественного определения фолликулов в яичниках культивированный молодых мышей без последовательного секционирование. Используя весь орган иммунофлюоресценции и очистки ткани, физические секционирование заменяется оптических секционирование. Этот метод пробоподготовки и визуализации обеспечивает целостность орган и облегчает автоматизированного количественного определения конкретных клеток.
Abstract
Исследования в области репродуктивной биологии млекопитающих часто включает в себя оценку общего состояния здоровья яичников и яичек. В частности у самок, яичников фитнес часто оценивается визуализации и количественного определения фолликулов и яйцеклеток. Потому что яичник является непрозрачным трехмерные ткани, традиционные подходы требуют, кропотливо нарезка ткани в многочисленных последовательных секций для того, чтобы визуализировать клетки на протяжении всего органа. Кроме того потому что количественную оценку этим методом обычно влечет за собой, забив только подмножество разделов, разделенных приблизительный диаметр ооцитов, он подвержен неточность. Здесь Протокол описан, вместо этого использует весь орган ткани клиринга и иммунофлюоресценции пятнать мыши яичников для визуализации фолликулов и яйцеклеток. По сравнению с более традиционными подходами, этот протокол является выгодным для визуализации ячеек в яичнике по многим причинам: 1) завязи остается неизменным на протяжении пробоподготовки и обработки; 2) небольшой яичников, которые трудно секции, может рассматриваться с легкостью; 3) сотовых количественной достигается более легко и точно; и 4) весь орган воспроизведен образ.
Introduction
С целью изучения клеточного состава и морфологические особенности млекопитающих яичников, ученые часто полагаются на в естественных условиях экспериментов следуют иммуногистохимического окрашивания парафина встроенных яичников. Более недавно, хотя, весь яичник органной культуры оказалась эффективной альтернативой для изучения функции яичников1,2,3,4 , потому что техника может использоваться в сочетании с лучшей визуализации и инструменты количественной оценки. Традиционно анализ морфологии яичников зависит от реконструкции трехмерной яичников архитектуры из парафина встроенных последовательных секций, но, являясь трудоемким и много времени, последовательно секционирование встроенных парафин ткани не гарантирует надлежащего реконструкции органа, и разделы часто теряются или неправильно заказаны в процессе.
Помимо технических проблем, связанных с последовательным секционирование существуют также различия в методах, регулярно используется для количественного определения фолликула номеров каждой завязи5,6. Методологические изменчивость в настоящее время используется повреждает мета анализ овариальный запас через исследования5,7. Например фолликул чисел из различных научно-исследовательских статей может варьироваться от десятикратного или более возрасте подобные развития в пределах конкретного штамма6. Эти большие различия в сообщил фолликула количественной оценки может привести к путанице и препятствуют кросс исследование сравнения. Экспериментально, традиционные подходы к количественной фолликул из последовательных секций выполняются путем подсчета фолликулов предварительно определенное количество разделов (например, каждый пятый, десятый, или другой раздел). Изменчивость в фолликул графов с помощью этого подхода возникает не только от периодичности в разделы, которые считаются, но и от вариации в разделе толщина и технический опыт в создании последовательной разделы5,6. В дополнение к его изменчивости еще один недостаток традиционных тканей секционирование является секционирование малых яичников из молодых животных особенно сложным и сильно зависит от ориентации ткани8.
Протокол ниже описывает регулярно используемых завязи культуры техника1 , но значительно улучшает количественной оценки традиционных фолликула путем замены физической секционирование с очистки ткани и оптических секционирование с помощью конфокальной микроскопии8 ,9. Очистка с помощью погружения ткани (без необходимости для транскраниальной перфузии или электрофорез) в мочевины и сорбитол-на основе решения (например, ScaleS(0)10) оказались совместимыми с иммуноокрашивания и разрешено для уменьшения Очистка время без ущерба для глубины изображения. Другие сообщили методы (например, ScaleA28,10, SeeDB11,12ClearT и12ClearT2), либо больше времени или не позволяют углубленного оптическое разрешение образца. Оптическая секционирование выгодно, потому что это менее трудоемким и поддерживает орган трехмерной архитектуры7,8. Другим преимуществом этого подхода является подготовка образцов не требует дорогостоящих реагентов для очистки ткани и может проводиться с относительной легкостью.
В частности Протокол описал был оптимизирован для искусственного мыши яичников на послеродовой день пять но был проведен на яичниках, начиная от послеродового день 0 – 10. Этот метод использует систему культуры яичников, в котором ткани естественно придает мембраны, на которой выращиваются, содействия орган обработки и манипуляции. Описываемой культуры системы может использоваться для поддержания описаны яичников на срок до 10 дней и для оценки различных экспериментальных условий могут мешать ооцитов выживания13. Количественная оценка процедура, описанная выполняется с помощью обработки пакета Фиджи-ImageJ14 изображений некоммерческого и может проводиться на большинстве персональных компьютеров. Кроме того изображения, используемые для количественной оценки можно сделать широко доступными для научного сообщества, таким образом позволяя для будущих мета анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение mammalian воспроизведение требует использование и количественная оценка специализированных клеток, которые не регулярно поддаются клеточной культуры. Однако ex vivo культуры системы являются эффективными в сохранении яичников и фолликул жизнеспособности1,<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ребекка Уильямс и Johanna Dela Cruz от Корнелл BRC Imaging и Эндрю Recknagel за полезные предложения и техническую помощь. Эта работа была поддержана в национальные институты здравоохранения грант S10-OD018516 (Фонду Корнелла Imaging), T32HD057854 к J.C.B. и R01-GM45415 для J.C.S.
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
Referências
- O’Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts – not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genética. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Biologia do Desenvolvimento. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, (2017).
