पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस और प्रसंस्कृत माउस अंडाशय के कूप ठहराव
Summary
यहां, हम धारावाहिक अनुभाग के बिना युवा चूहों के कल्चरल अंडाशय में रोम यों तो एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । पूरे अंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस और ऊतक समाशोधन का उपयोग करना, शारीरिक अनुभाग ऑप्टिकल अनुभाग के साथ बदल दिया है । नमूना तैयारी और दृश्यावलोकन का यह तरीका अंग अखंडता को बनाए रखता है और विशिष्ट कोशिकाओं के स्वचालित ठहराव की सुविधा देता है.
Abstract
स्तनधारी प्रजनन जीवविज्ञान के क्षेत्र में अनुसंधान अक्सर अंडाशय और परीक्षण के समग्र स्वास्थ्य का मूल्यांकन शामिल है । विशेष रूप से, महिलाओं में, डिम्बग्रंथि स्वास्थ्य अक्सर visualizing और मात्रा रोम और अंडाणुओं द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । क्योंकि अंडाशय एक अपारदर्शी तीन आयामी ऊतक है, पारंपरिक दृष्टिकोण laboriously की आवश्यकता होती है कई धारावाहिक वर्गों में ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया क्रम में पूरे अंग भर में कोशिकाओं कल्पना करने के लिए । इसके अलावा, क्योंकि इस विधि द्वारा ठहराव आमतौर पर केवल एक oocyte के अनुमानित व्यास से अलग वर्गों का एक सबसेट स्कोरिंग जोर देता है, यह अशुद्धि से ग्रस्त है । यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है कि बजाय पूरे अंग ऊतक समाशोधन और माउस अंडाशय के धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस के रोम और अंडाणुओं कल्पना का इस्तेमाल करता है । अधिक पारंपरिक दृष्टिकोण की तुलना में, इस प्रोटोकॉल कई कारणों के लिए अंडाशय के भीतर कोशिकाओं visualizing के लिए लाभप्रद है: 1) अंडाशय नमूना तैयारी और प्रसंस्करण भर में बरकरार रहता है; 2) छोटे अंडाशय, जो अनुभाग के लिए मुश्किल हैं, आसानी से जांच की जा सकती है; 3) सेलुलर ठहराव अधिक आसानी से और सही ढंग से हासिल की है; और 4) पूरे अंग छवि ।
Introduction
आदेश में सेलुलर संरचना और स्तनधारी अंडाशय के रूपात्मक सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए, वैज्ञानिकों अक्सर vivo में तेल एंबेडेड अंडाशय के धुंधला immunohistological के बाद प्रयोगों पर भरोसा करते हैं । हाल ही में हालांकि, पूरे अंडाशय अंग संस्कृति एक प्रभावी करने के लिए डिम्बग्रंथि समारोह1,2,3,4 क्योंकि तकनीक बेहतर दृश्य के साथ युग्मित किया जा सकता है और अध्ययन करने के लिए विकल्प साबित हो गया है ठहराव उपकरण । परंपरागत रूप से, डिंबग्रंथि आकृति विज्ञान का विश्लेषण आयल एंबेडेड धारावाहिक वर्गों से तीन आयामी डिम्बग्रंथि वास्तुकला के पुनर्निर्माण पर निर्भर करता है, लेकिन, श्रमसाध्य और समय लेने के लिए, प्रश्नपत्र अनुभागीय तेल एंबेडेड ऊतक होने के अलावा अंग के उचित पुनर्निर्माण की गारंटी नहीं है, और वर्गों अक्सर खो रहे हैं या गलत प्रक्रिया में आदेश दिया.
धारावाहिक अनुभागीकरण के साथ जुड़े तकनीकी चुनौतियों के अलावा, वहाँ भी नियमित रूप से अंडाशय5,6प्रति कूप संख्या मात्रा के लिए इस्तेमाल किया तरीकों में बदलाव कर रहे हैं । methodological परिवर्तनशीलता वर्तमान में प्रयोग किया जाता है5,7के बीच डिंबग्रंथि आरक्षित के मेटा विश्लेषण । उदाहरण के लिए, विभिंन अनुसंधान लेख से कूप संख्या 10 गुना या एक विशिष्ट तनाव में समान विकास उंर के बीच अधिक से भिंन हो सकते है6। रिपोर्ट कूप ठहराव में इन बड़े मतभेद भ्रम पैदा कर सकते है और पार अध्ययन तुलना बाधा है । प्रयोग, धारावाहिक वर्गों से कूप ठहराव के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण एक पूर्व के रोम गिनती वर्गों की संख्या निर्धारित (जैसे, हर पांचवें, दसवें, या अंय खंड) द्वारा किया जाता है । कूप में परिवर्तनशीलता गिनती इस दृष्टिकोण का उपयोग न केवल आवधिकता में जो वर्गों की गणना कर रहे हैं, लेकिन यह भी अनुभाग मोटाई में बदलाव से, और धारावाहिक वर्गों5पैदा करने में तकनीकी अनुभव से उठता है,6। अपनी परिवर्तनशीलता के अलावा, पारंपरिक ऊतक अनुभाग के एक और नुकसान यह है कि युवा जानवरों से छोटे अंडाशय के अनुभाग विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है और ऊतक अभिविंयास8पर अत्यधिक निर्भर है ।
नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है एक नियमित रूप से इस्तेमाल किया अंडाशय संस्कृति तकनीक1 लेकिन बहुत पारंपरिक कूप ठहराव पर सुधार के साथ शारीरिक अनुभाग के साथ ऊतक समाशोधन और ऑप्टिकल फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अनुभाग8 ,9. एक यूरिया में (transcranial छिड़काव या ट्रो के लिए आवश्यकता के बिना) ऊतक विसर्जन का उपयोग कर समाशोधन-और सोर्बिटोल-आधारित समाधान (जैसे, तराजू (0)10) immunostaining के साथ संगत साबित कर दिया और की कमी के लिए अनुमति दी इमेजिंग की गहराई से समझौता किए बिना समय समाशोधन । अन्य रिपोर्ट की गई विधियाँ (उदा., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12, और ClearT212) या तो अधिक समय लेने वाले हैं या में गहराई ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन नमूने की अनुमति नहीं है । ऑप्टिकल खोदी लाभप्रद है क्योंकि यह कम श्रम गहन है और अंग तीन आयामी वास्तुकला7,8का कहना है । इस दृष्टिकोण का एक और लाभ यह है कि नमूनों की तैयारी महंगा रिएजेंट ऊतक स्पष्ट करने की आवश्यकता नहीं है और रिश्तेदार आसानी से आयोजित किया जा सकता है ।
विशेष रूप से, वर्णित प्रोटोकॉल जन्मोत्तर दिवस पांच पर संस्कृतिपूर्ण माउस अंडाशय के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन जन्मोत्तर दिन 0-10 से लेकर अंडाशय पर आयोजित किया गया है । विधि एक अंडाशय संस्कृति प्रणाली है जिसमें ऊतक स्वाभाविक रूप से झिल्ली है जिस पर यह संस्कृति है, अंग हैंडलिंग और हेरफेर की सुविधा के लिए देता है का उपयोग करता है । संस्कृति प्रणाली को 10 दिनों तक के लिए explanted अंडाशय को बनाए रखने और कैसे अलग प्रयोगात्मक स्थितियों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है oocyte अस्तित्व के साथ हस्तक्षेप कर सकते है13। ठहराव प्रक्रिया वर्णित गैर वाणिज्यिक छवि प्रसंस्करण पैकेज फिजी-ImageJ14 का उपयोग किया जाता है और सबसे अधिक व्यक्तिगत कंप्यूटर पर आयोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, ठहराव के लिए इस्तेमाल किया छवियों वैज्ञानिक समुदाय के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध कराया जा सकता है, इस प्रकार भविष्य मेटा विश्लेषण के लिए अनुमति ।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्तनधारी प्रजनन के अध्ययन का उपयोग करने और विशेष कोशिकाओं है कि नियमित रूप से सेल संस्कृति के लिए उत्तरदाई नहीं है बढ़ाता की आवश्यकता है । हालांकि, पूर्व vivo संस्कृति प्रणालियों अंडाशय और कूप व्यवहा…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी सुझावों और तकनीकी सहायता के लिए कॉर्नेल BRC इमेजिंग और एंड्रयू Recknagel से रेबेका विलियंस और Johanna देला Cruz धंयवाद । यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान S10-OD018516 (कॉर्नेल की इमेजिंग सुविधा के लिए), T32HD057854 को J.C.B. और R01-GM45415 को J.C.S. करने के लिए समर्थन किया गया था
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
Referências
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