培养小鼠卵巢的全贴装免疫荧光和卵泡定量研究
Summary
在这里, 我们提出一项协议, 以量化卵泡在培养卵巢小鼠没有连续切片。用全器官免疫荧光和组织清除, 用光学切片代替物理切片。这种样品制备和可视化方法保持了器官的完整性, 促进了特定细胞的自动定量。
Abstract
在哺乳动物生殖生物学领域的研究通常涉及评估卵巢和睾丸的整体健康。具体来说, 在女性中, 卵巢健康通常通过形象化和定量卵泡和卵母细胞来评估。由于卵巢是一个不透明的三维组织, 传统的方法需要费力地切片的组织成许多序列切片, 以便可视化整个器官细胞。此外, 由于这种方法的量化通常只需要评分的一部分, 由大约卵母细胞的直径分开, 它容易不准确。在这里, 一个协议被描述, 而不是利用整个器官组织清除和免疫荧光染色小鼠卵巢, 以可视化卵泡和卵母细胞。与传统方法相比, 该协议有利于在卵巢内可视化细胞, 原因有很多: 1) 卵巢在样品制备和加工过程中保持完好;2) 小卵巢不易切片, 可轻松检查;3) 细胞量化更容易、更准确地实现;和 4) 整个器官成像。
Introduction
为了研究哺乳动物卵巢的细胞组成和形态学特征, 科学家们经常依赖于体内实验, 其次是石蜡嵌入卵巢的免疫组织化学染色。最近, 虽然整个卵巢器官培养已被证明是研究卵巢功能的有效替代方案1,2,3,4 , 因为该技术可以结合更好的可视化和量化工具。传统上, 卵巢形态学分析依靠石蜡嵌入序列切片重建三维卵巢结构, 但除了费力和耗时, 连续切片石蜡嵌入组织不保证器官的适当的重建, 并且区段经常丢失或错误地命令在过程中。
除了与串行切片相关的技术难题外, 通常用于量化每个子房的卵泡数的方法也有变化5,6。目前使用的方法变异在研究中损害了卵巢储备的 meta 分析5,7。例如, 不同研究文章中的卵泡数在特定应变6中的相似发育年龄之间可能会有10倍或更多的变化。这些在报告的卵泡数量上的巨大差异会导致混淆, 并阻碍了交叉研究的比较。实验中, 从序列切片中进行卵泡定量的传统方法是通过计数一个预先定义的节数 (例如,每第五、第十或其他部分) 的卵泡来完成的。使用这种方法的卵泡计数的变异性不仅来自于计算节数的周期性, 而且还产生于截面厚度的变化, 以及生成串行部分5、6的技术经验。除了变异外, 传统组织切片的另一个缺点是, 幼兽的小卵巢的切片特别具有挑战性, 并且高度依赖于组织方向8。
下面的协议描述了常规使用的卵巢培养技术1 , 但大大改善了传统的卵泡定量替代物理切片与组织清除和光学切片使用共焦显微镜8 ,9。用组织浸泡 (不需要经颅灌注或电泳) 在尿素和山梨醇基溶液中 (例如,刻度 (0)10) 的清除被证明与染色兼容, 并允许减少清除时间而不损害成像深度。其他报告的方法 (例如、ScaleA28、10、SeeDB11、ClearT12和 ClearT212) 要么更耗时, 要么不允许对示例进行深入的光学解析。光学切片是有利的, 因为它是少劳动密集型和维护器官的三维体系结构7,8。这种方法的另一个好处是, 样品的制备不需要昂贵的试剂来清除组织, 而且可以相对容易地进行。
具体而言, 所描述的协议已被优化为培养的小鼠卵巢在产后五天, 但已经进行了卵巢范围从产后一天 0-10。该方法利用卵巢培养系统, 组织自然附着在其培养的膜上, 促进器官的处理和操作。所描述的培养系统可用于维持说明卵巢长达10天, 并评估不同实验条件对卵母细胞存活率的影响13。所描述的量化程序是使用非商业图像处理包 (斐济-ImageJ14 ) 进行的, 可以在大多数个人计算机上进行。此外, 用于量化的图像可以广泛地提供给科学界, 从而允许将来进行 meta 分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究哺乳动物的繁殖需要使用和量化的专门细胞, 不定期服从细胞培养。但是, “体外” 区域性系统在维护子房和卵泡生存能力 1,15中是有效的。在卵巢培养过程中, 组织需要更大的表面积来通过扩散来交换养分。因此, 5 天大鼠卵巢是理想的大小和形状的器官培养。该协议是为七天的文化中保持的卵巢进行了优化, 但卵巢培养长度可以根据具体的科学…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢丽贝卡威廉斯和乔安娜德拉库拉克鲁兹从康奈尔的 Recknagel 成像和安德鲁的帮助建议和技术援助。这项工作得到了国家卫生研究所资助 S10-OD018516 (康奈尔的影像设施), T32HD057854 J.C.B. 和 R01-GM45415 J.C.S。
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
Referências
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