Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.
Abstract
Direkte elektrochemische Detektion von c-Typ Cytochrom-komplexe, eingebettet in die äußeren bakterienmembran (äußere Membran c-Typ Cytochrom-komplexe; OM c– Cyts) hat vor kurzem erwies sich als eine neuartige ganze Zelle analytische Methode um den bakteriellen Elektronentransport aus der Atmungskette der Zelle äußeren zu charakterisieren, als die extrazelluläre Elektronentransport (EET) bezeichnet. Während der Weg und die Kinetik der Elektronenfluss während der EET Reaktion untersucht wurden, hat eine ganze Zelle elektrochemische Methode zu prüfen, die Auswirkungen des kation Verkehrs EET zugeordnet noch nicht etabliert. In der vorliegenden Studie wird ein Beispiel für eine biochemische Technik zu prüfen, die Deuterium kinetische Isotop Wirkung (KIE) auf EET durch OM c– Cyts mit einem Modell Mikrobe, Shewanella Oneidensis MR-1, beschrieben. Die KIE auf den EET-Prozess erhalten Sie EET durch OM c– Cyts fungiert als die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der mikrobiellen laufenden Produktion. Zu diesem Zweck vor der Zugabe von D2O ersetzte die überstehende Lösung mit frischen Medium mit einer ausreichenden Menge an der Elektron-Spender, die Rate der vorgelagerten Stoffwechselreaktionen zu unterstützen und eine einheitliche planktonischen Zellen entfernen Monolage Biofilm an der Arbeitselektrode. Alternative Methoden zur Bestätigung die Bandbreitenbegrenzung Schritt mikrobielle laufende Produktion als EET durch OM c– Cyts werden ebenfalls beschrieben. Unsere Technik eines ganzen Zelle elektrochemische Assays für die Untersuchung von Proton Transport Kinetik kann auf andere Elektroaktive mikrobielle Belastungen angewendet werden.
Introduction
Elektrochemische Techniken um ein Redox-Protein in einer intakten bakteriellen Zelle direkt zu charakterisieren sind seit der Entdeckung der Metall-reduzierende mikrobielle Belastungen, z. B. S. Oneidensis MR-1 oder Geobacter Sulfurreducens PCA vor kurzem entstanden, äußere Membran Cytochrom c-Typ-komplexe (OM c-Cyts) ausgesetzt, die Zelle außen1,2,3,4,5haben. Das OM cvermitteln – Cyts Elektronentransport aus der Atmungskette auf festen Untergründen befindet sich extrazellulär. Dieser Transport wird als extrazelluläre Elektronentransport (EET)1,6 bezeichnet und ist ein kritischer Prozess für neue Biotechnologien, wie mikrobielle Brennstoffzellen-6. Daher, um die zugrunde liegenden EET-Kinetik und Mechanismen und seiner Verbindung zum mikrobielle Physiologie verstehen, OM c –Cyts wurden untersucht mit ganzen Zelle Elektrochemie4,7, kombiniert mit Mikroskopie 8 , 9, Spektroskopie10,11und Molekularbiologie2,4. Im Gegensatz dazu haben Methoden, um den Einfluss der EET-assoziierten kation Transport, z. B. Protonen, auf EET Kinetik in lebenden Zellen untersuchen kaum trotz PROTONENTRANSPORT über bakterielle Membranen haben eine entscheidende Rolle im festgestellt wurde, Signalisierung, Homöostase und Energie Produktion12,13,14. In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Technik, um die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT auf EET Kinetik in der S. Oneidensis MR-1 Zelle mit Hilfe von ganzen Zelle elektrochemischen Messungen, zu untersuchen, die die Identifikation der Bandbreitenbegrenzung Schritt erfordert mikrobielle aktuelle Produktion15.
Eine direkte Möglichkeit, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT auf die damit verbundenen EET zu bewerten ist der Deuterium-kinetische Isotop-Effekt (KIE). Die KIE ist zu beobachten, wie die Veränderung der Electron Transfer Kinetik auf den Ersatz von Protonen mit Deuterium-Ionen, der die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT Electron Transfer Kinetik16darstellt. Die Theorie der KIE selbst hat mit elektrochemischen Messungen mit gereinigtem Enzyme17gut etabliert. Jedoch da aktueller Produktion in S. Oneidensis MR-1 aus mehrere, unterschiedliche und schwankende Prozesse18, kann man einfach EET als die Bandbreitenbegrenzung Prozess nicht identifizieren. Um die KIE auf Proton Transportprozesse gepaart mit EET zu beobachten, müssen wir bestätigen, dass die mikrobiellen laufenden Produktion durch Elektronentransport durch OM cbegrenzt ist – Cyts an der Elektrode. Zu diesem Zweck haben wir die überstehende Lösung durch frisches Medium mit einer hohen Konzentration von Laktat als ein Elektron Spender an der optimalen pH und Temperaturbedingungen vor KIE Messung ersetzt; Dieser Ersatz diente zwei Rollen: (1) erhöht die Rate der vorgelagerten Stoffwechselprozesse im Vergleich zu den EET, und (2) ausgelassen die Zellen Schwimmen im überstand der Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 auf den arbeitenden Elektrode (befreit Indium-Zinn-dotierte oxid (ITO)-Elektrode). Die vorgestellte ausführliche Protokoll soll helfen neue Praktiker erhalten und bestätigen, dass die EET-Bestimmung Schritt erfolgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere ganze Zelle elektrochemischen Test hat einige technische Vorteile verglichen mit Protein Elektrochemie. Während Proteinreinigung mehrstufige zeitaufwändige Verfahren erfordert, dauert unsere gesamte-Cell-Methode einen Tag von selbstorganisierten Biofilmbildung nach Zellkultur. Um eine stabile Wechselwirkung zwischen OM czu erreichen – Cyts und der Elektrode, brauchen wir nur Sterilisation und Reinigung der Elektrodenoberfläche; Es erfordert keine Elektrode Modifikation für organisieren die Ausrichtung…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für speziell gefördert Forschung von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-Nummer 24000010, 17 H 04969, und JP17J02602, die uns Office of Naval Research Global (N62909-17-1-2038) finanziell unterstützt. Y.T JSPS Research Fellow und unterstützt von JSPS durch das Programm für führende Graduierten Schulen (Verdienst).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
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