Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme
Summary
Bu iletişim kuralı spectrophotometrically trans-plazma membran elektron taşıma ekstraselüler elektron alıcısı kullanan izlemek ve bu hücre dışı elektron alıcısı ile oluşabilir enzimatik etkileşimleri analiz için hedeftir.
Abstract
Trans-plazma membran elektron taşıma (tPMET) hücre dışı oksidanlar ile hücre içi indirgeyici stres hücrelerden korunması hem de hasar koruma bir rol oynar. Bu işlem için hücre dışı oksidanlar hücre içi reductants elektron taşıma iyi tanımlanmış değildir. Burada hücre dışı elektron alıcısı kullanan tPMET izlemek için C2C12 myotubes tarafından spektrofotometrik deneyleri mevcut: suda çözünen tetrazolium tuz-1 (WST-1) ve 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP veya DCIP). Bu elektron alıcısı azaltılması, biz gerçek zamanlı analiz bu süreçte izlemek edebiliyoruz. Enzimler askorbat oksidaz (AO) ve süperoksit dismutaz (SOD) deneyleri için gibi eklenmesiyle, biz tPMET kısmını askorbat verme ya da süperoksit üretimi nedeniyle sırasıyla belirleyebilirsiniz. WST-1 düşük arka plan ile istikrarlı sonuçlar üretmek için gösterildi iken, DPIP AO ve spektrofotometrik analiz ile gösterilmiştir SOD eklenmesi sonra yeniden oksitlenmiş olmayı başardı. Bu yöntem bir gerçek zamanlı, çok iyi, hızlı spektrofotometrik tahlil tPMET, ferricyanide (FeCN) ve ferricytochrome c azaltma gibi izlemek için kullanılan diğer yöntemler üzerinde avantajları ile gösterilmektedir.
Introduction
Saf plazma membran elektron alıcısı azaltma becerisini plazma zarı doğasında Redoks kapasitesi1sahip görünümüne yol açmıştır. Daha önce görüldü mantar, bitki ve hayvan, tPMET bir işlemi birden çok organizmalar2,3,4,5‘ e ortak var. Saccharomyces cerevisiae, havuç hücreleri, eritrositler, lenfositler, osteosarkom, Melanom, makrofajlar, iskelet kası ve nötrofil2,3, bu işlem özellikle gösterilmiştir 4 , 5 , 6 , 7. hücre dışı oksidanlar azaltmak için plazma zarı arasında elektron taşıma bir süreç içinde tPMET de dahil olmak üzere birçok hücresel işlevler ilgilenmektedir: hücre büyüme5,8, hücre canlılığı9, demir metabolizma10,11,12,13ve Reaktif oksijen türleri12,14,15koruma sinyalizasyon hücre. Pek çok hücresel fonksiyon tPMET’ın katılımı nedeniyle, tPMET bir dengesizlik kanser16, kardiyovasküler hastalık17, dahil olmak üzere bazı ciddi sağlık koşulları, gelişimine katkıda bulunmak olan ve metabolik Sendromu18.
Plazma zarı arasında elektron transferi izlemek için birden çok yolu vardır, ancak en çok kullanılan teknik ekstraselüler elektron alıcısı Renkölçer deneyleri ile azalma değerlendirmek için. Yaygın olarak kullanılan hücre dışı elektron alıcısı tetrazolium tuzları, DPIP, FeCN ve ferricytochrome c19,20dir. En sık kullanılan tetrazolium WST-119bilinen ikinci nesil bir tuz tuzudur. Bu bileşik Renkölçer deneyleri ilk nesil tetrazolium tuzlar, su çözünürlük21artırmak iki Sülfonat grup nedeniyle göre kullanmak kolaydır. WST-1, iki tek-elektron transferi olaylar ara elektron alıcısı 1-metoksi-phenazine methosulfate (MPM), ile birlikte azalır. Bu azalma WST-1 zayıf renkli oksitlenmiş şeklinde bir daha yoğun, sarı formazan20,22‘ ye değişir. WST-1 37 x 103 M-1cm-1, yüksek molar tükenme katsayısı bir yüksek tahlil duyarlılık21,22‘ ye lider vardır. DPIP da tPMET izlemek için bir hücre dışı elektron alıcısı olarak kullanılmaktadır. Bu DPIP extracellularly tPMET ara elektron alıcısı23,24yardımı olmadan tarafından azaltılabilir gösterilmiştir. Ara elektron alıcısı olmaması nedeniyle DPIP doğrudan WST-124aksine plazma zarı pick-up elektron olabilir. Benzer şekilde DPIP, extracellularly ferrocyanide için tPMET ara elektron alıcısı19,24yardımı olmadan düşülmesi için FeCN gösterilmiştir. WST-1 ve DPIP, FeCN bir alt tahlil duyarlılık9için önde gelen bir düşük molar tükenme katsayısı vardır. TPMET izlemek için başka bir sık kullanılan hücre dışı elektron alıcısı ferricytochrome c. WST-1, ferricytochrome c azaltma artar ara elektron alıcısı, MPM22kullanımı ile benzer olduğunu. WST-1 olsa da, ferricytochrome c yöntemi yüksek bir arka plan ve düşük molar tükenme katsayısı22nedeniyle daha az duyarlıdır.
Burada tPMET spektrofotometrik deneyleri aracılığıyla gerçek zamanlı analiz için bir yöntem mevcut. Ekstraselüler elektron alıcısı ferricytochrome c gibi diğer yaygın olarak karşılaştırıldığında olmak daha ucuz kullanılan iken her ikisi de yüksek molar tükenme katsayısı gibi WST-1 ve DPIP, hücre dışı elektron alıcısı yöntemi kullanılmıştır. Biz phenazine methosulfate (PMS) kullanılan MPM’ler yerine onlar-si olmak benzer kimyasal makyaj ve PMS çok daha az pahalı. MPM’ler uzun bir raf ömrü ihtiyacı bir ticari kiti için önemli bir özelliği olan photochemically stabil. İstikrar sorunu olmamalı böylece Ancak, biz PMS her tahlil için taze olun. Biz de hücre dışı elektron alıcısı ve daha fazla tPMET süreci karakterize için kullanılması gereken enzimler arasındaki olası enzimatik etkileşimler (bkz. şekil 1) değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Özellikle, AO ve SOD kullanılan enzimler tPMET kısmını askorbat taşıma veya hücre dışı süperoksit açıklaması, plazma zarı arasında taşınması elektron için iki yaygın yöntem nedeniyle belirlemek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz hücre dışı elektron alıcısı, WST-1 ve DPIP, C2C12 myotubes tPMET izlemek için spektrofotometrik deneyleri içinde kullanmak için iki yöntem sundu. Spektrofotometre plaka okuyucu ve hücre hatlarında standart kültür yordamlar büyüme ile tPMET bu elektron alıcısı basit Mikroplaka tahlil ile izlemek mümkündür. İyi iyi bir tahlil içinde WST-1 azaltma tekrarlanabilir değil ama gün-gün değişkenlik var. PBS arabellek olarak kullanan varyasyon (CV) günlük fark 0.18 ve arabellek 0,23 olduğu gibi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino ve Neej Patel ve teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Jonathan Fisher için Amerika Birleşik Devletleri halk sağlığı hizmet Ödülü R15DK102122 diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları (NIDDK) tarafından desteklenmiştir. El yazması içerik sadece yazarlar sorumludur ve mutlaka NIDDK veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
Referências
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Bioquímica. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
- Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
- Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
- Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
- Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
- Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
- Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
- Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Bioquímica. 33, 11850-11857 (1994).
- Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
- Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).
- Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
- Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
- Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
- Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
- Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
- Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
- . . R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
- Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
- Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
- Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
- Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
- Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
- Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
- Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
- Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
- Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
- Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
- Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).
