Mäta Trans-Plasma membran elektrontransport av C2C12 Myotubes

Renat plasma membran förmåga att minska Elektronacceptorer har lett till att plasmamembranet har en inneboende redox kapacitet¹. TPMET tidigare sett i svampar, växter och djur, och är en process som är gemensamma för flera organismer^2,3,4,5. Specifikt, har denna process visats i Saccharomyces cerevisiae, morot celler, erytrocyter, lymfocyter, osteosarkom, melanom, makrofager, skelettmuskel och neutrofiler^{2,3, 4 , 5 , 6 , 7}. en process som transporterar elektroner över plasmamembranet att minska extracellulära oxidanter, tPMET är involverad i många cellulära funktioner inklusive: cell tillväxt^5,8, cell livskraft⁹, järn ämnesomsättningen¹⁰, cell signalering^11,12,13och skydd från reaktivt syre arter^12,14,15. På grund av Tpmet’s medverkan i många cellulära funktioner, har en obalans i tPMET antagit hypotesen för att bidra till utvecklingen av vissa allvarliga hälsotillstånd, inklusive cancer¹⁶, hjärt-kärlsjukdom¹⁷, och metaboliska syndrom¹⁸.

Det finns flera sätt att övervaka överföring av elektroner över plasmamembranet, men den mest använda tekniken är att bedöma minskningen av extracellulära Elektronacceptorer genom kolorimetrisk analyser. Vanligen används extracellulära Elektronacceptorer är tetrazolium salter, DPIP, FeCN och ferricytochrome c^19,20. Det vanligaste tetrazolium saltet är en andra generationens salt känd som WST-1¹⁹. Denna förening är lättare att utnyttja kolorimetriska analyser jämfört med första generationens tetrazolium salter på grund av två sulfonat grupper, som ökar dess vatten löslighet²¹. WST-1, reduceras jämförd med den mellanliggande elektron acceptorn 1-metoxi-phenazine metosulfat (mPMS), i två single-elektronöverföring händelser. Denna minskning ändrar svagt färgade oxiderade form av WST-1 till en mer intensiv, gul formazan^20,22. WST-1 har en hög molar extinktionskoefficient 37 x 10³ M^-1cm^-1, vilket leder till en hög assay känslighet^21,22. DPIP utnyttjas också som en extracellulär Elektronacceptor att övervaka tPMET. Det har visat att DPIP kan minskas extracellularly genom tPMET utan hjälp av mellanliggande elektron acceptorer^23,24. På grund av mellanliggande Elektronacceptorer, DPIP direkt kan pickupen elektroner från plasmamembranet, till skillnad från WST-1²⁴. Liknar DPIP, FeCN har visat att minskas extracellularly till kaliumferrocyanid genom tPMET utan hjälp av mellanliggande elektron acceptorer^19,24. Till skillnad från WST-1 och DPIP har FeCN en låg molar extinktionskoefficient leder till en lägre analysens känslighet⁹. En annan vanligt förekommande extracellulära Elektronacceptor att övervaka tPMET är ferricytochrome c. liknar WST-1, ferricytochrome c minskning ökar med användning av mellanliggande Elektronacceptor, mPMS²². Till skillnad från WST-1 dock är ferricytochrome c metoden mindre känslig på grund av en hög bakgrund och en låg molar absorption koefficient²².

Här presenterar vi en metod för realtidsanalys av tPMET genom spektrofotometrisk analyser. Metoden utnyttjas de extracellulära Elektronacceptorer WST-1 och DPIP, som de båda har en hög molar extinktionskoefficient medan att vara mindre dyr jämfört med andra ofta används extracellulära Elektronacceptorer såsom ferricytochrome c. Vi utnyttjade phenazine metosulfat (PMS) i stället för mPMS de har en liknande kemisk makeup och PMS är betydligt billigare. mPMS är photochemically stabila vilket ett viktigt kännetecken för en kommersiell kit som behöver en lång hållbarhet. Men gör vi PMS färska för varje analys, så stabilitet inte bör vara ett problem. Vi presenterar också en metod för att utvärdera möjliga enzymatisk interaktioner (se figur 1) mellan extracellulära Elektronacceptor och enzymer som kan utnyttjas för att ytterligare karakterisera processen för tPMET. Specifikt, avgöra de enzymer som AO och SOD kan användas som del av tPMET beror på askorbat transport eller extracellulära superoxid release, två vanliga metoder för elektronerna transporteras över plasmamembranet.