Измерения транс плазмы мембраны переноса электронов, C2C12 Myotubes
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в спектрофотометрически контролировать транс плазмы мембраны электронного транспорта используя внеклеточного электрон акцепторов и проанализировать ферментативные взаимодействия, которые могут произойти с эти внеклеточные электрона акцепторами.
Abstract
Транс плазмы мембраны переноса электронов (tPMET) играет роль в защите клеток от внутриклеточного редуктивной стресса, а также защиту от повреждений, внеклеточная окислителей. Этот процесс транспортировки электроны от внутриклеточного восстановителях внеклеточного окислителей не является правильно определенным. Здесь мы представляем спектрофотометрические анализы по C2C12 myotubes следить за tPMET, используя внеклеточного электрон акцепторов: водорастворимые tetrazolium соль-1 (WST-1) и 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP или DCIP). Путем сокращения этих акцепторов электронов мы в состоянии контролировать этот процесс в режиме реального времени анализа. С добавлением ферментов, таких как аскорбат оксидазы (AO) и супероксиддисмутазы (СОД) для анализов мы можем определить, какая часть tPMET объясняется аскорбат экспорта или супероксид производства, соответственно. В то время как WST-1 было показано производить стабильные результаты с низким фоном, DPIP был в состоянии быть повторно окисленные после добавления AO и SOD, которая была продемонстрирована с спектрофотометрический анализ. Этот метод демонстрируется в реальном времени, несколько хорошо, быстро спектрофотометрические пробирного с преимущества по сравнению с другими методами, используемыми для наблюдения за tPMET, как Гексацианоферрат (FeCN) и c сокращение ferricytochrome.
Introduction
Очищенная плазменных мембран возможность уменьшения акцепторов электронов привело к считает, что плазматической мембраны имеет присущие окислительно-восстановительного потенциала1. Ранее видели в грибов, растений и животных, tPMET представляет собой процесс, общие для нескольких организмов2,3,4,5. В частности этот процесс был продемонстрирован в Saccharomyces cerevisiae, морковь клеток, эритроцитов, лимфоцитов, остеосаркома, меланома, макрофаги, скелетных мышц и нейтрофилов2,3, 4 , 5 , 6 , 7. в процессе, который перевозит электронов через плазматической мембраны для уменьшения внеклеточного окислителей, tPMET участвует в многих клеточных функций, в том числе: рост клеток5,8, жизнеспособность клеток9, железо метаболизм10, сигнализации11,12,13и защита от реактивнооксигенных видов12,,1415клеток. Из-за tPMET в причастности многих клеточных функций, дисбаланс tPMET был предположил вносить вклад в развитие некоторых серьезных заболеваний, включая рак16,17сердечно-сосудистых заболеваний и метаболических синдром18.
Существует несколько способов для отслеживания передачи электронов через плазматическую мембрану, но наиболее широко используемый метод заключается в оценке сокращения акцепторов внеклеточного электронов через колориметрические анализов. Часто используемые внеклеточного электрона акцепторов являются соли tetrazolium, DPIP, FeCN и ferricytochrome c19,20. Наиболее часто используемым tetrazolium соль является второго поколения соли известный как19WST-1. Это соединение проще использовать в колориметрические анализов по сравнению с первого поколения tetrazolium соли из-за две группы сульфонат, которые увеличивают его растворимость воды21. WST-1, в сочетании с промежуточных электрон акцептора 1-метокси мембранотропного порфириновых (МПМ), уменьшается в два одного электрона передачи событий. Это сокращение меняется слабо цвета окисленной формы WST-1 к более интенсивным, желтые Формазаны20,22. WST-1 имеет коэффициент Высокая молярная вымирания 37 x 103 M-1см-1, приводит к высокой пробирного чувствительность21,22. DPIP также используется в качестве акцептора внеклеточного электронов для мониторинга tPMET. Было показано, что DPIP может быть внеклеточно уменьшен tPMET без помощи промежуточных электронных акцепторов23,24. Из-за отсутствия промежуточных электронных акцепторов DPIP может непосредственно пикап электроны от плазматической мембраны, в отличие от WST-124. Подобно DPIP, FeCN было показано, быть уменьшена внеклеточно для Ферроцианид tPMET без помощи промежуточных электронных акцепторов19,24. В отличие от WST-1 и DPIP FeCN имеет коэффициент низкий Молярная вымирания приводит к нижней пробирного чувствительность9. Другой часто используемые внеклеточного электрон акцептора следить за tPMET-ferricytochrome c. аналогичен WST-1, ferricytochrome c сокращение увеличивается с использованием промежуточных электрон акцептора, МПМ22. Хотя, в отличие от WST-1 c метод ferricytochrome менее чувствительным из-за высокой фон и коэффициент низкий Молярная исчезновения22.
Здесь мы представляем метод для в реальном времени анализ tPMET через спектрофотометрические анализов. Метод используется внеклеточного электрона акцепторов WST-1 и DPIP, как они оба имеют коэффициентом Высокая молярная вымирания, в то время как существо менее дорогостоящим по сравнению с другими широко используется акцепторов внеклеточного электронов как ferricytochrome c. Мы использовали мембранотропного порфириновых (PMS) вместо МП они имеют аналогичного химического состава и PMS гораздо дешевле. МПМ воздухе стабилен, которая является важной характеристикой для коммерческих комплект, который нуждается в длительный срок. Однако мы делаем PMS свежие для калибровочных, поэтому стабильность не должно быть проблемой. Мы также представляем метод для оценки возможных ферментативные взаимодействий (см. Рисунок 1) между внеклеточным электрон акцептора и ферменты, которые могут быть использованы для дальнейшей характеризации процесс tPMET. В частности ферменты, которые AO и SOD могут использоваться определить какая часть tPMET благодаря аскорбат транспорта или внеклеточная супероксид релиз, два общих метода для электронов перевозиться через плазматическую мембрану.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили два метода для использования внеклеточного электрон акцепторов, WST-1 и DPIP, в спектрофотометрические анализов для мониторинга tPMET в C2C12 myotubes. С ростом клеточных линий в стандартных культуры процедурах и читатель спектрофотометр пластины можно контролировать tPMET с этих акц?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Томас Белл, Lyn Mattathil, Марк Манино и Neej Patel за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения США награду R15DK102122 из Национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (NIDDK) Джонатан Fisher. Рукопись содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIDDK или национальных институтов здравоохранения.
Materials
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
Referências
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Bioquímica. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
- Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
- Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
- Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
- Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
- Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
- Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
- Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Bioquímica. 33, 11850-11857 (1994).
- Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
- Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).
- Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
- Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
- Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
- Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
- Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
- Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
- . . R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
- Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
- Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
- Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
- Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
- Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
- Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
- Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
- Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
- Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
- Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
- Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).
