Måle Trans-Plasma membran elektronet Transport av C2C12 Myotubes

Av renset plasma membraner redusere muligheten elektron acceptors har ført til visningen at plasma membranen har en iboende redoks kapasitet¹. Tidligere sett i sopp, planter og dyr, er tPMET en prosess som er felles for flere organismer^2,3,4,5. Spesielt har denne prosessen blitt demonstrert i Saccharomyces cerevisiae, gulrot celler, erytrocytter, lymfocytter, osteosarcoma, melanom, makrofager, skjelettlidelser muskel og nøytrofile^{2,3, 4 , 5 , 6 , 7}. i en prosess som transporterer elektroner i plasma membranen å redusere ekstracellulære oksidanter, tPMET er involvert i mange cellulære funksjoner inkludert: celle vekst^5,8, celle levedyktighet⁹, jern metabolisme¹⁰, celle signalisering^11,12,13, og beskyttelse fra reaktive oksygen arter^12,14,15. På grunn av Tpmet’s engasjement i mange cellulære funksjoner, en ubalanse i tPMET har blitt antatt bidra til utviklingen av noen alvorlige helsemessige forhold, inkludert kreft¹⁶, hjerte-og karsykdommer¹⁷, og metabolske syndrom¹⁸.

Det finnes flere måter å overvåke overføring av elektroner i plasma membranen, men den mest brukte metoden er å vurdere reduksjon av ekstracellulære elektron acceptors gjennom kolorimetrisk analyser. Brukte ekstracellulære elektron acceptors er tetrazolium salter, DPIP, FeCN og ferricytochrome c^19,20. Den mest brukte tetrazolium saltet er en andregenerasjons salt kjent som WST-1-¹⁹. Denne forbindelsen er enklere å bruke i kolorimetrisk analyser sammenlignet med første generasjon tetrazolium salter på grunn av to sulfonate grupper, som øke sine vannløselighet²¹. WST-1, er i forbindelse med middels elektron acceptor 1-metoksy-phenazine methosulfate (mPMS), redusert i to én-elektron overføre hendelser. Denne reduksjonen endres svakt-farget oksidert form av WST-1 til en mer intens, gul formazan^20,22. WST-1 har en høy molar utryddelse koeffisient av 37 x 10³ M^-1cm^-1, fører til en høy analysen følsomhet^21,22. DPIP benyttes også som en ekstracellulære elektron godkjenner å overvåke tPMET. Det har vist at DPIP reduseres extracellularly ved tPMET uten hjelp av mellomliggende elektron acceptors^23,24. På grunn av manglende mellomliggende elektron acceptors, DPIP kan direkte pick-up elektroner fra plasma membranen, i motsetning til WST-1-²⁴. Lik DPIP, FeCN har vist å være redusert extracellularly til ferrocyanide med tPMET uten hjelp av mellomliggende elektron acceptors^19,24. I motsetning WST-1 og DPIP har FeCN en lav molar utryddelse koeffisient fører til en lavere analysen følsomhet⁹. En annen vanlig ekstracellulære elektron acceptor overvåke tPMET er ferricytochrome c. ligner WST-1, ferricytochrome c reduksjon øker med bruk av mellomliggende elektron acceptor, mPMS²². I motsetning WST-1 men er metoden ferricytochrome c mindre sensitive høy bakgrunn og en lav molar utryddelse koeffisienten²².

Her presenterer vi en metode for sanntids analyse av tPMET gjennom Spektrofotometri analyser. Metoden benyttes ekstracellulære elektron acceptors WST-1 og DPIP, som begge har en høy molar utryddelse koeffisient mens blir billigere sammenlignet med andre ofte brukte ekstracellulære elektron acceptors ferricytochrome c. Vi utnyttet phenazine methosulfate (PMS) i stedet for mPMS de har en lignende kjemisk makeup og PMS er langt billigere. mPMS er photochemically stabil som er et viktig karakteristisk for en kommersiell kit som trenger lang holdbarhet. Vi gjør imidlertid PMS fersk hver analysen, så stabilitet ikke bør være et problem. Vi presenterer også en metode for å vurdere mulig enzymatisk samspillet (se figur 1) mellom ekstracellulære elektron acceptor og enzymer som kan benyttes for å karakterisere videre prosessen med tPMET. Spesielt avgjøre enzymer AO og TORV hvilken del av tPMET er ascorbate transport eller ekstracellulær superoxide utgivelse, to vanlige metoder for elektroner transporteres over plasma membranen.