Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è di monitorare spettrofotometricamente trans-plasma membrana elettrone trasporto utilizzando accettori extracellulari e di analizzare le interazioni enzimatiche che possono verificarsi con questi accettori extracellulari.
Abstract
Trans-plasma membrana electron transport (tPMET) svolge un ruolo nella protezione delle cellule dallo stress riduttivo intracellulare così come protezione da danni da ossidanti extracellulari. Questo processo di trasporto di elettroni da riducenti intracellulare agli ossidanti extracellulari non è ben definito. Qui vi presentiamo le analisi spettrofotometriche di miotubi C2C12 per monitorare tPMET utilizzando gli accettori extracellulari: sale di tetrazolio solubile in acqua-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). Attraverso la riduzione di questi accettori, siamo in grado di monitorare questo processo in un’analisi in tempo reale. Con l’aggiunta di enzimi come la superossido dismutasi (SOD) per l’analisi e l’ascorbato ossidasi (AO), possiamo determinare quale parte del tPMET è a causa della produzione di superossido o esportazione dell’ascorbato, rispettivamente. Mentre WST-1 è stato indicato per produrre risultati stabili con fondo basso, DPIP è stato in grado di essere ri-ossidato dopo l’aggiunta di AO e SOD, che è stata dimostrata con analisi spettrofotometriche. Questo metodo dimostra un’analisi spettrofotometrica in tempo reale, multi-pozzetto e veloce con vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per il monitoraggio tPMET, come ferricianuro (FeCN) e ferricitocromo c riduzione.
Introduction
La capacità delle membrane plasmatiche purificate per ridurre accettori ha condotto alla vista che la membrana plasmatica ha un redox intrinseca capacità1. Precedentemente visto in funghi, piante e animali, tPMET è un processo comune a più organismi2,3,4,5. In particolare, questo processo è stato dimostrato in Saccharomyces cerevisiae, cellule di carota, eritrociti, linfociti, osteosarcoma, il melanoma, macrofagi, muscolo scheletrico e neutrofili2,3, 4 , 5 , 6 , 7. in un processo che trasporta gli elettroni attraverso la membrana plasmatica per ridurre extracellulari ossidanti, tPMET è coinvolto in molte funzioni cellulari tra cui: cella crescita5,8, cellula attuabilità9, Ferro da stiro metabolismo10,11,12,13e protezione da ossigeno reattivo specie12,14,15di segnalazione delle cellule. A causa del coinvolgimento di tPMET in molte funzioni cellulari, uno squilibrio di tPMET è stata supposta per contribuire allo sviluppo di alcune condizioni di salute gravi, tra cui cancro16, malattia cardiovascolare17e metabolica la sindrome18.
Ci sono diversi modi per monitorare il trasferimento di elettroni attraverso la membrana plasmatica, ma la tecnica più ampiamente usata è quello di valutare la riduzione di accettori extracellulari attraverso saggi colorimetrici. Accettori extracellulari comunemente utilizzati sono sali di tetrazolio, DPIP e FeCN ferricitocromo c19,20. Il sale di tetrazolio più comunemente usato è un noto sale seconda generazione come WST-119. Questo composto è più facile da utilizzare in saggi colorimetrici rispetto ai sali di tetrazolio di prima generazione a causa di due gruppi solfonato, che aumentano la sua acqua solubilità21. WST-1, in concomitanza con l’intermedio elettrone accettore 1-metossi-fenazina methosulfate (MPM), è ridotto in eventi di due trasferimento singolo elettrone. Questa riduzione cambia la forma ossidata debolmente colorato di WST-1 a un più intenso, giallo formazan20,22. WST-1 ha un coefficiente di estinzione molare alta di 37 x 103 M-1cm-1, portando a un dosaggio ad alta sensibilità21,22. DPIP viene anche utilizzato come un ricettore dell’elettrone extracellulare per monitorare tPMET. È stato dimostrato che DPIP può essere ridotto extracellularly di tPMET senza l’ausilio di intermedi elettroni accettori23,24. A causa della mancanza di accettori intermedi, DPIP può direttamente gli elettroni di pick-up dalla membrana del plasma, a differenza di WST-124. Simile a DPIP, FeCN ha dimostrato di essere ridotto extracellularly a ferrocianuro di tPMET senza l’ausilio di intermedi elettroni accettori19,24. A differenza di WST-1 e DPIP, FeCN ha un coefficiente di estinzione molare basso che conduce a un più basso dosaggio sensibilità9. Un altro accettore di elettroni extracellulare comunemente usate per monitorare tPMET è ferricitocromo c. simile a WST-1, ferricitocromo c riduzione aumenta con l’uso di accettore di elettroni intermedi, mPMS22. A differenza di WST-1 però, il metodo di ferricitocromo c è meno sensibile a causa di un’alta priorità bassa e un coefficiente di estinzione molare basso22.
Qui presentiamo un metodo per l’analisi in tempo reale di tPMET attraverso analisi spettrofotometriche. Il metodo utilizzato l’accettori extracellulari WST-1 e DPIP, dato che entrambi hanno un coefficiente di estinzione molare alta mentre essendo meno costoso rispetto agli altri comunemente usato accettori extracellulari quali ferricitocromo c. Abbiamo utilizzato fenazina methosulfate (PMS) invece di mPMS hanno una composizione chimica simile e PMS è molto meno costoso. mPMS è fotochimicamente stabile che è una caratteristica importante per un kit commerciale che ha bisogno di una lunga shelf life. Tuttavia, facciamo PMS fresco per ogni dosaggio, quindi stabilità non dovrebbe essere un problema. Presentiamo anche un metodo per valutare le possibili interazioni enzimatiche (Vedi Figura 1) tra il ricettore dell’elettrone extracellulare ed enzimi che possono essere utilizzati per caratterizzare ulteriormente il processo di tPMET. In particolare, gli enzimi AO e SOD può essere usato determinano quale parte del tPMET è dovuto al trasporto dell’ascorbato o rilascio extracellulare del superossido, due metodi comuni per gli elettroni essere trasportato attraverso la membrana plasmatica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato due metodi per utilizzare extracellulare accettori, WST-1 e DPIP, nelle analisi spettrofotometriche per monitorare tPMET in miotubi C2C12. Con la crescita di linee cellulari nelle procedure standard di cultura e di un lettore di piastra spettrofotometro, è possibile monitorare tPMET con questi accettori in un’analisi semplice micropiastra. WST-1 riduzione è riproducibile dal pozzetto a altro all’interno di un test, ma non c’è variabilità giorno per giorno. Il quotidiano coefficiente di variazione (…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal premio United States Public Health Service R15DK102122 dall’Istituto nazionale di diabete e digestivo e malattie renali (NIDDK) a Jonathan Fisher. Il contenuto del manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale il NIDDK o il National Institutes of Health.
Materials
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
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