Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Die Fähigkeit des gereinigten Plasmamembranen, Elektronen-Akzeptoren reduzieren führte zu der Ansicht, dass der Plasmamembran ein Redox-inhärente Kapazität¹hat. Zuvor in Pilzen, Pflanzen und Tiere gesehen, ist tPMET ein Prozess üblich, mehrere Organismen^2,3,4,5. Insbesondere wurde dabei in Saccharomyces Cerevisiae, Karotte Zellen, Erythrozyten, Lymphozyten, Osteosarkom, Melanom, Makrophagen, Skelettmuskel und Neutrophilen^2,3, nachgewiesen ^{4 , 5 , 6 , 7}. in einem Prozess, der Elektronen über die Plasmamembran extrazelluläre Oxidantien reduzieren transportiert, tPMET engagiert sich in vielen Zellfunktionen einschließlich: Zelle Wachstum^5,8, Zelle überleben⁹, Eisen Stoffwechsel¹⁰, Zelle^11,12,13, und Schutz vor reaktiven Sauerstoff-Spezies^12,14,15. Aufgrund des tPMET Engagements in vielen Zellfunktionen, Hypothese aufgestellt die ein Ungleichgewicht von tPMET als Beitrag zu der Entwicklung von einigen schweren gesundheitlichen Bedingungen, einschließlich Krebs¹⁶, Herz-Kreislauf-Krankheit¹⁷, und Stoffwechselerkrankungen Syndrom¹⁸.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, um die Übertragung von Elektronen in der Plasmamembran zu überwachen, aber die am häufigsten verwendete Technik ist die Reduzierung der extrazellulären Elektronen Akzeptoren durch farbmetrische Assays zu beurteilen. Häufig verwendete extrazelluläre Elektronen Akzeptoren sind tetrazoliumsalz Salze, ‑Aufklärung, FeCN und Ferricytochrome C^19,20. Das am häufigsten verwendete Tetrazolium-Salz ist als WST-1¹⁹eine zweite Generation Salz bekannt. Diese Verbindung ist einfacher zu nutzen in farbmetrische Untersuchungen im Vergleich zur ersten Generation tetrazoliumsalz Salze durch zwei Sulfonate Gruppen, die die Wasser Löslichkeit²¹zu erhöhen. WST-1, wird in Verbindung mit der mittleren Elektron Akzeptor 1-Methoxy-phenazinderivat Methosulfate (Komponenten), in zwei Einzel-Elektronentransfer Ereignisse reduziert. Diese Reduktion ändert die schwach gefärbte oxidierte Form von WST-1 zu einer intensiveren, gelbe Formazan^20,22. WST-1 hat eine hohe molare Aussterben Koeffizient von 37 x 10³ M^-1cm^-1, führt zu einer hohen Assay Empfindlichkeit^21,22. ‑Aufklärung wird auch als eine extrazelluläre Elektron Akzeptor tPMET Überwachung genutzt. Es hat sich gezeigt, dass ‑Aufklärung tPMET ohne die Hilfe eines zwischengeschalteten Elektronen Akzeptoren^23,24extrazellulär gesenkt werden kann. Aufgrund des Fehlens der Mittelstufe Elektronen-Akzeptoren ‑Aufklärung können direkt Pick-up Elektronen aus der Plasmamembran, im Gegensatz zu WST-1²⁴. Ähnlich wie bei ‑Aufklärung, FeCN nachweislich extrazellulär tPMET ohne die Hilfe eines zwischengeschalteten Elektronen Akzeptoren^19,24, ferrocyanid gesenkt werden. Im Gegensatz zu WST-1 und ‑Aufklärung hat FeCN eine niedrige molare Aussterben Koeffizient führt zu einem geringeren Assay Empfindlichkeit⁹. Eine andere häufig verwendete extrazelluläre Elektron Akzeptor, tPMET zu überwachen ist Ferricytochrome c. WST-1, Ferricytochrome C Reduktion steigt mit dem Einsatz von mittleren Elektron Akzeptor, Komponenten²²ähnlich. Im Gegensatz zu WST-1 ist jedoch die Ferricytochrome C Methode aufgrund hoher Hintergrund und eine niedrige molare Aussterben Koeffizient²²weniger empfindlich.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Echtzeit-Analyse des tPMET durch photometrische Tests. Die Methode genutzt die extrazelluläre Elektronen-Akzeptoren WST-1 und ‑Aufklärung, da sie beide einen hohen molaren Aussterben Koeffizienten haben, während weniger teuer im Vergleich zu den anderen häufig extrazelluläre Elektronen-Akzeptoren wie Ferricytochrome c eingesetzt. Wir nutzten phenazinderivat Methosulfate (PMS) anstelle von Komponenten haben sie eine ähnliche chemische Zusammensetzung und PMS ist weit weniger teuer. Komponenten ist photochemisch stabilen ein wichtiges Merkmal für eine kommerzielle Kit, die eine lange Haltbarkeit. Jedoch machen wir PMS frisch für jeden Test, damit Stabilität kein Problem sein sollte. Wir präsentieren auch eine Methode zur Evaluierung möglicher enzymatischer Interaktionen (siehe Abbildung 1) zwischen der extrazellulären Elektron Akzeptor und Enzyme, die genutzt werden können, um den Prozess der tPMET weiter zu charakterisieren. Insbesondere ermitteln die Enzyme, die AO und SOD verwendet werden kann, welcher Teil des tPMET ist durch Ascorbat Transport oder extrazellulären Superoxid Version, zwei gängige Methoden für Elektronen über die Plasmamembran transportiert werden.