Trans-Plasma Membrane Transport des électrons par les Myotubes C2C12 de mesure
Summary
Ce protocole vise à surveiller par spectrophotométrie trans-plasma membrane transport d’électrons utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire et d’analyser les interactions enzymatiques qui peuvent survenir avec ces accepteurs d’électrons extracellulaire.
Abstract
TRANS-plasma membrane transport d’électrons (tPMET) joue un rôle dans la protection des cellules du stress réductrice intracellulaire ainsi que la protection contre les dommages causés par les oxydants extracellulaires. Ce processus de transport des électrons de réducteurs intracellulaires extracellulaire oxydants n’est pas bien défini. Nous présentons des analyses spectrophotométriques de myotubes C2C12 pour surveiller tPMET utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire : tétrazolium soluble dans l’eau sel-1 WST-1 et 2, 6-dichlorophénolindophénol (DPIP ou DCIP). Grâce à la réduction de ces accepteurs d’électrons, nous sommes en mesure de contrôler ce processus dans une analyse en temps réel. Avec l’ajout d’enzymes telles que l’ascorbate oxydase (AO) et de la superoxyde dismutase (SOD) pour les essais, nous pouvons déterminer quelle partie du tPMET est due à la production de superoxyde ou de l’exportation d’ascorbate, respectivement. WST-1 a montré des résultats stables avec faible bruit de fond, DPIP a pu être ré-oxydé après l’ajout des AO et des mottes de terre, qui a été démontrée avec l’analyse spectrophotométrique. Cette méthode montre un dosage spectrophotométrique multipuit, rapide, en temps réel avec les avantages par rapport aux autres méthodes utilisées pour surveiller les tPMET, tels que ferricyanure (FeCN) et ferricytochrome c réduction.
Introduction
La capacité des membranes de plasma épurés de réduire les accepteurs d’électrons a conduit à l’idée que la membrane plasmique a une capacité inhérente redox1. Vu précédemment dans les champignons, les plantes et animaux, tPMET est un processus commun à plusieurs organismes2,3,4,5. Plus précisément, ce processus a été démontré chez Saccharomyces cerevisiae, cellules de carotte, érythrocytes, lymphocytes, ostéosarcome, mélanome, macrophages, le muscle squelettique et neutrophiles2,3, 4 , 5 , 6 , 7. dans un processus qui transporte les électrons à travers la membrane de plasma pour réduire les oxydants extracellulaires, tPMET est impliqué dans nombreuses fonctions cellulaires, y compris : cellule croissance5,8, de la viabilité cellulaire9, fer métabolisme des10,11,12,13et protection contre l’oxygène réactif espèces12,14,15de signalisation cellulaire. En raison de l’implication de tPMET dans de nombreuses fonctions cellulaires, un déséquilibre de tPMET a émis l’hypothèse pour contribuer au développement de certains troubles de santé graves, y compris le cancer16,17de maladies cardiovasculaires, métaboliques et le syndrome18.
Il y a plusieurs façons de contrôler le transfert des électrons à travers la membrane de plasma, mais la technique la plus largement utilisée est d’évaluer la réduction des accepteurs d’électrons extracellulaire par dosages colorimétriques. Accepteurs d’électrons extracellulaire couramment utilisés sont les sels de tétrazolium, DPIP, FeCN et ferricytochrome c19,20. Le sel de tetrazolium plus couramment utilisé est un deuxième génération connu sel comme WST-119. Ce composé est plus facile à utiliser dans les essais colorimétriques par rapport aux sels de tétrazolium de première génération en raison de deux groupes de sulfonate de perfluorooctane, qui augmentent sa solubilité de l’eau21. WST-1, en liaison avec l’intermédiaire électron accepteur 1-méthoxy-phénazine méthosulfate (mPMS), est réduite dans les événements de transfert d’électron deux. Cette réduction change la forme oxydée de faiblement couleur du WST-1 à une plus intense, jaune de formazan20,22. WST-1 a un coefficient d’extinction molaire élevée de 37 x 103 M-1cm-1, conduisant à un dosage haute sensibilité21,22. DPIP est également utilisé comme un accepteur d’électrons extracellulaire pour surveiller tPMET. Il a été démontré que DPIP peut être réduit extracellulaire par tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs23,24. En raison de l’absence d’accepteurs d’électrons intermédiaire, DPIP peut directement électrons pick-up de la membrane plasmique, contrairement à WST-124. Semblable à DPIP, FeCN s’est avéré extracellulaire réduit à ferrocyanure de tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs19,24. Contrairement à WST-1 et DPIP, FeCN a un coefficient d’extinction molaire bas menant à un plus faible dosage sensibilité9. Un autre accepteur d’électron d’extracellulaire couramment utilisés pour surveiller les tPMET est ferricytochrome c. semblable à WST-1, ferricytochrome c réduction augmente avec l’utilisation d’accepteur d’électrons intermédiaire, mPMS22. Contrairement à WST-1, la méthode de ferricytochrome c est moins sensible en raison d’un haut fond et une extinction molaire faible coefficient22.
Nous présentons ici une méthode d’analyse en temps réel de tPMET par le biais de dosages par spectrophotométrie. La méthode utilisée les accepteurs d’électrons extracellulaire WST-1 et DPIP, car ils ont un coefficient d’extinction molaire élevée tout en étant moins cher par rapport à l’autre couramment utilisé accepteurs d’électrons extracellulaire comme ferricytochrome c. Nous avons utilisé la phénazine méthosulfate (PMS) au lieu de MPM, ils ont une composition chimique similaire et PMS est beaucoup moins cher. mPMS photochimiquement stable qui est une caractéristique importante pour une trousse commerciale qui a besoin d’une longue durée de vie. Toutefois, nous faisons PMS frais pour chaque dosage, donc stabilité ne devrait pas être un problème. Nous présentons aussi une méthode pour évaluer les possibles interactions enzymatiques (voir Figure 1) entre l’accepteur d’électron extracellulaire et des enzymes qui peuvent être utilisés afin de caractériser le processus de tPMET. Plus précisément, les enzymes AO et SOD peuvent servir déterminent quelle partie du tPMET est due à transport ascorbate ou communiqué de superoxyde extracellulaire, deux méthodes courantes pour les électrons d’être transporté à travers la membrane plasmique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté deux méthodes d’utilisation d’accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP, dans des dosages spectrophotométriques pour surveiller les tPMET dans les myotubes C2C12. Avec la croissance de lignées cellulaires dans les méthodes de culture standard et d’un lecteur de spectrophotomètre, il est possible de surveiller tPMET avec ces accepteurs d’électrons dans un essai simple microplaque. WST-1 réduction est reproductible de puits à puits dans un essai, mais il existe une varia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino et Neej Patel pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par l’award de l’United States Public Health Service R15DK102122 de l’Institut National du diabète et l’appareil digestif et la Kidney Diseases (NIDDK) à Jonathan Fisher. Le contenu du manuscrit est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NIDDK ou le National Institutes of Health.
Materials
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
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