Måling af Trans-Plasma membran elektron Transport af C2C12 Myotubes
Summary
Målet med denne protokol er spektrofotometrisk overvåge trans-plasma membran elektron transport udnytte ekstracellulære elektronacceptorer og analysere enzymatisk interaktioner, der kan opstå med disse ekstracellulære elektronacceptorer.
Abstract
Trans-plasma membran elektron transport (tPMET) spiller en rolle i beskyttelsen af celler fra intracellulære reduktiv stress samt beskyttelse mod beskadigelse af ekstracellulære oxidanter. Denne proces til at transportere elektroner fra intracellulære reduktionsmidler til ekstracellulære oxidanter er ikke veldefineret. Her præsenterer vi spektrofotometriske assays af C2C12 myotubes til at overvåge tPMET udnytter de ekstracellulære elektronacceptorer: vandopløselige tetrazolium salt-1 (WST-1) og 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP eller DCIP). Gennem reduktion af disse elektronacceptorer er vi i stand til at overvåge denne proces i en real-time analyse. Med tilføjelsen af enzymer såsom Ascorbat oxidase (AO) og superoxiddismutase (SOD) for assays, kan vi afgøre, hvilken del af tPMET er Ascorbat eksport eller superoxid produktion, henholdsvis. Mens WST-1 blev vist sig at producere stabile resultater med lav baggrund, kunne DPIP være re oxideret efter tilsætning af AO og SOD, hvilket blev demonstreret med spektrofotometriske analyse. Denne metode viser en real-time, multi godt, hurtig spektrofotometriske assay med fordele frem for andre metoder, der anvendes til at overvåge tPMET, som Ferricyanid (FeCN) og ferricytochrome c reduktion.
Introduction
Renset plasma membraner evne til at reducere elektronacceptorer har ført til den opfattelse, at plasma membranen har en iboende redox kapacitet1. Tidligere set i svampe, planter og dyr, er tPMET en proces, der er fælles for flere organismer2,3,4,5. Specifikt, er denne proces blevet påvist i Saccharomyces cerevisiae, gulerod celler, erytrocytter, lymfocytter, osteosarkom, melanom, makrofager, skeletmuskulatur og neutrofile2,3, 4 , 5 , 6 , 7. i en proces, der transporterer elektroner over plasmamembran at reducere ekstracellulære oxidanter, tPMET er involveret i mange cellulære funktioner, herunder: celle vækst5,8, celle levedygtighed9, jern metabolisme10, celle signalering11,12,13, og beskyttelse mod reaktive ilt arter12,14,15. På grund af Tpmet’s involvering i mange cellulære funktioner, en ubalance i tPMET har været en hypotese for at bidrage til udviklingen af nogle alvorlige sundhedsmæssige betingelser, herunder kræft16, hjerte-kar-sygdom17, og metabolisk syndrom18.
Der er flere måder at overvåge overførslen af elektroner over plasmamembran, men den mest udbredte teknik er at vurdere reduktion af ekstracellulære elektronacceptorer gennem kolorimetriske assays. Almindeligt anvendte ekstracellulære elektronacceptorer er tetrazolium salte, DPIP, FeCN og ferricytochrome c19,20. De mest almindeligt anvendte tetrazolium salt er en anden generation salt kendt som WST-119. Dette stof er lettere at udnytte i kolorimetriske assays i forhold til første generation tetrazolium salte på grund af to sulfonat grupper, der øger dens vand opløselighed21. WST-1, er sammenholdt med mellemliggende elektron acceptor 1-methoxy-phenazine methosulfate (mPMS), reduceret i to enkelt-elektron overførsel begivenheder. Denne reduktion ændres svagt farvede oxiderede form af WST-1 til en mere intens, gule formazankoncentrationen20,22. WST-1 har en høj molær ekstinktion koefficient på 37 x 103 M-1cm-1, fører til et højt assay følsomhed21,22. DPIP er også udnyttes som en ekstracellulære elektron acceptoren til at overvåge tPMET. Det har vist sig at DPIP kan reduceres extracellularly ved tPMET uden hjælp af mellemliggende elektron acceptorer23,24. På grund af manglende mellemliggende elektronacceptorer, DPIP kan direkte afhentning elektroner fra plasma membran, i modsætning til WST-124. Svarende til DPIP, FeCN har vist sig at være reduceret extracellularly til kaliumferrocyanid af tPMET uden hjælp af mellemliggende elektron acceptorer19,24. I modsætning til WST-1 og DPIP har FeCN en lav molær ekstinktion koefficient fører til en lavere assay følsomhed9. En anden almindeligt anvendte ekstracellulære elektron acceptoren til at overvåge tPMET er ferricytochrome c. svarende til WST-1, ferricytochrome c reduktion stigninger med brug af mellemliggende elektron acceptor, mPMS22. I modsætning til WST-1 men er metoden ferricytochrome c mindre følsomme på grund af en stor baggrund og en lav molær ekstinktion koefficient22.
Her vil vi præsentere en metode for tidstro analyse af tPMET gennem spektrofotometriske assays. Metoden udnyttes de ekstracellulære elektronacceptorer WST-1 og DPIP, som de begge har en høj molær ekstinktion koefficient, mens at være billigere i forhold til de andre almindeligt anvendte ekstracellulære elektronacceptorer som ferricytochrome c. Vi udnyttede phenazine methosulfate (PMS) i stedet for mPMS de har en lignende kemisk makeup og PMS er langt billigere. mPMS er photochemically stabilt som er et vigtigt kendetegn for en kommerciel kit, der har bør for en lang holdbarhed. Men vi gør PMS frisk i hvert assay, så stabilitet ikke bør være et problem. Vi præsenterer også en metode til at vurdere mulige enzymatisk interaktioner (Se figur 1) mellem de ekstracellulære elektron acceptor og enzymer, der kan udnyttes til at yderligere karakterisere processen med tPMET. Specifikt, bestemme enzymer AO og SOD kan bruges, hvilken del af tPMET skyldes Ascorbat transport eller ekstracellulære superoxid udgivelse, to fælles metoder for elektronerne transporteres over plasmamembran.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har præsenteret to metoder for at udnytte ekstracellulære elektronacceptorer, WST-1 og DPIP, i spektrofotometrisk assays til at overvåge tPMET i C2C12 myotubes. Med væksten i cellelinjer i standard kultur procedurer og et spektrofotometer Pladelæser er det muligt at overvåge tPMET med disse elektronacceptorer i en simpel mikrotiterplade assay. WST-1 reduktion er reproducerbare fra godt til godt inden for en analyse, men der er den daglige variation. Den daglige variationskoefficient (CV) udnytte PBS som bufferen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino og Neej Patel for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af USA ‘s Public Health Service award R15DK102122 fra National Institute for Diabetes og Digestive og nyre sygdomme (NIDDK) til Jonathan Fisher. Håndskriftets indhold er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NIDDK eller National Institutes of Health.
Materials
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
Referências
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Bioquímica. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
- Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
- Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
- Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
- Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
- Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
- Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
- Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Bioquímica. 33, 11850-11857 (1994).
- Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
- Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).
- Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
- Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
- Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
- Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
- Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
- Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
- . . R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
- Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
- Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
- Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
- Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
- Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
- Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
- Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
- Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
- Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
- Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
- Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).
