基于纠错 DNA 和 RNA 测序的稀有事件检测方法

1. 针对 DNA 的靶向误差校正测序 PCR 扩增的基因组片段的兴趣。 使用高保真 DNA 聚合酶放大 amplicons (材料表, 项目 1)。在热循环仪中, 用以下条件放大 PCR 反应: 三十年代在98°c;18–40周期十年代在98°c, 三十年代在66°c, 并且三十年代在72°c;2分钟在72°c;保持在4摄氏度。 用顺磁珠 (材料表, 项目 2) 纯化 PCR 产物。根据制造商的协议, 在 1: 1.8 比值 (PCR 反应体积: 珠体积) 中加入 pcr 反应。洗脱与20µL 的 ddH2O。 量化 dna 浓度 (材料表, 项目 3) 以确定 dna 的最终浓度。 在2% 琼脂糖凝胶 (材料表, 项目 4) 上运行一个整除的 DNA 来确认 amplicons 的大小。注意: 或者, 研究人员可以选择对 PCR 产品进行 Bioanalyzer 分析, 以确定扩增的基因组片段的大小以及产品的浓度。 顺序适配器退火 获得 i7 适配器 (材料表, 项目 5)。在为后续步骤提供它们时使用它们。 购买 16N i5 适配器商业与以下寡聚序列 (材料表项目 6): AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC (N1:25252525) (N1) (N1) (N1) (N1) (N1) (N1) (N1) (N1) (N1) (N1) (N1) (N1) N1注意: 16N i5 适配器替换标准 i5 适配器, 它们是带有16个随机核苷酸串的适配器, 以促进 ECS。 制作 16N i5 适配器工作解决方案:40 µL 100 µM 16N i5 适配器库存, 10 µL 的 TE 缓冲器, 10 µL 500 µM NaCl 溶液。 整除7.5 µL 的 i5 工作解决方案, 在步骤1.2.3 成单独的 PCR 井。 将5µL 的样品专用 i7 适配器添加到相应的井中。 孵育在95°c 为5分钟然后冷却由1°c 每三十年代到4°c 在热循环仪。 保持在4摄氏度。 图书馆的尾修 & 大尾砂注: 与适配器退火并行, 可以在1.1 步的 PCR amplicons 上进行端修复和大尾矿。完成这些步骤后, 将退火的适配器从步骤1.2 结扎到末端修复和大尾 PCR amplicons。继适配器结扎后, ECS 库结构已完成。 开始与最多1µg 的起始 DNA (最小值 200 ng) 在 amplicons (材料表, 项目 7) 上执行最终修复和大尾。 添加3.0 µL 的端准备酶组合和6.5 µL 的末端修复缓冲器。 孵育混合30分钟在20°c, 然后30分钟在65°c 和举行在4°c。 对退火的适配器 (材料表, 项目 8) 进行结扎。 从步骤2、15µL 的钝/TA 连接酶 Mastermix 和1µL 的结扎增强剂中添加2.5 µL 的退火适配器。 孵育混合15分钟在20°c, 然后15分钟在37°c。 用磁性珠子清理库 (材料表项目 2): 在修改后的1中添加 pcr 反应: 0.75 比值 (pcr 反应体积: 磁珠容积): 将62.6 µL 的磁珠溶液注入83.5 µL 的 PCR 产物中, 从步骤1.2.7。 将混合物转移到1.5 毫升低结合管。 彻底混合, 吹打至少10次。 让混合物在室温下站立5分钟。 把管子放到磁性支架上。在室温下孵化2分钟或直到上清。 移除上清。 用200µL 70% 乙醇清洗珠子。 孵化三十年代. 去除乙醇。 重复乙醇洗涤步骤一次。 空气干燥的珠子。 洗脱与20µL 的 ddH2O。注: 这种对磁珠比的 PCR 反应将优先去除小于 200 bp 的 DNA 片段。 液滴数字 PCR 定量注意: 精确的突变量化要求严格遵守每个库中加载到排序器上的分子数。为了实现这一目标, 使用 QX200 液滴数字 pcr (ddPCR) 平台对每个单位体积的单个库的分子数量进行量化, 定量 pcr 是一种替代选择。在 ddPCR 分析之后, 读数将指定每个库每µL 的分子数。 稀释的 ECS 库 1:1, 000 通过增量稀释的因素10在 PCR 条管。 准备以下 mastermix 为 ddPCR 在1.5 毫升管:10 µL PCR 混合 (材料表, 项目 9), 0.2 µL P5 底漆, 0.2 µL 的 P7 底漆, 5 µL 的 ECS 清洁产品从步骤 1.4.1, 4.5 µL 2 O. 整除20µL 的 mastermix 到每个样品, 并确保有倍数8。 整除70µL 的水滴生成油 (材料表, 项目 10) 到每个油井。用橡皮垫圈盖上卡带。 使用液滴发生器 (材料表, 项目 11) 制作水滴。 使用多通道吸管, 将步进1.4.4 中生成的水滴加载到 PCR 盘中, 以确保样品的吹打在5秒的时间内慢慢完成, 以避免剪切 DNA。 使用以下条件在热循环仪中放大40循环的水滴中的信号: 5 分钟95°c;40周期三十年代在95°c, 1 分钟在63°c;5分钟在4°c, 5 分钟在90°c;然后保持在摄氏4摄氏度。 准备 ddPCR 模板滴读机 (材料表, 项目 11)。确保绝对量化参数的规范和使用QX200 ddPCR Eva 绿色 Supermix. 一旦 ddPCR 分析完成, 确保在所有样本中设置相同的分裂阈值。 利用 QX200 滴阅读器中的浓度读数, 整除适当的体积, 将所需的分子数引入到随后的步骤中。 序列库的 PCR 扩增 从步骤1.4.9 中为所需的分子数准备以下 mastermix:25 µL 的 Q5 mastermix (材料表, 项目 1), 2.5 µL P5 底漆 (10 µM), 2.5 µL 的 P7 底漆 (10 µM), X µL 的 DNA, 20-X µL ddH2O。 使用以下条件在热循环仪中从步骤1.5.1 放大库: 三十年代在98°c;20周期十年代在98°c, 三十年代在63°c, 三十年代在72°c;2分钟在72°c;然后保持在摄氏4摄氏度。 用磁性珠子 (材料表, 项目 2) 清理库: 在修改后的1中添加 pcr 反应: 0.75 比值 (pcr 反应体积: 磁珠容积)。 吸管37.5 µL 磁珠溶液进入50µL PCR 产品从步骤1.5.2。 将混合物转移到1.5 毫升低结合管。 彻底混合, 吹打至少10次。 让混合物在室温下站立5分钟。 把管子放到磁性支架上。在室温下孵化2分钟或直到上清。 移除上清。 用200µL 70% 乙醇清洗珠子。 孵化三十年代. 去除乙醇。 重复乙醇洗涤步骤一次。 空气干燥的珠子。 洗脱与20µL 的 ddH2O。 在2% 琼脂糖凝胶上运行整除的 DNA 来确认 amplicons 的大小。 量化 DNA 浓度 (材料表, 项目 3) 以确定独立的 ECS 库的浓度。 以摩尔的金额池库。注: 例如, 研究人员可以在一个摩尔组4中汇集八个库, 400万个起始分子用于测序, 该平台可输出多达4亿个读数。保守地, 建议使用平均十原始读数为差错改正每个分子。这将占去3.6亿读 (400万个分子 * 8 个图书馆 * 10 读为差错改正)。有400万个独特的分子每个图书馆, 研究人员可以期望得到一个理论上的平均共识读覆盖7042x 每扩增子 (4 million/568 amplicons 从基因小组)。 量化 DNA 浓度 (材料表, 项目 3), 以确定汇集的 ECS 图书馆的浓度。 将汇集的 ECS 库提交大约 4 nM。 向 Illumina 排序平台 (MiSeq、HiSeq 或 NextSeq) 提供以下排序设置: 2×144 配对端读取、8循环索引1和16循环索引2。 2. 基因小组以错误改正的脱氧核糖核酸测序 基因组寡核苷酸的杂交研究注意: 在此步骤中, 您将使用修改后的 Illumina TruSight 或 TruSeq 协议构造排序库, 以合并 UMIs (材料表, 项目 17)。 杂交寡核苷酸根据制造商的协议在基因组片段上。使用250的 DNA (或任何所需的起始材料量)。 按照制造商的协议删除未绑定寡核苷酸。 按照制造商的协议执行扩展结扎。注意: 对制造商协议的修改从下面开始。 通过 PCR 技术将 i5 和 i7 适配器合并 通过将以下试剂吹打到适当体积尺寸的管中制备 PCR mastermix: 37.5 µL Q5 mastermix (材料表, 项目 1), 6 µL 10 µM 16N i5 适配器 (在方法1、步骤1.2.2 中详细说明)、µL 适配器 6 i7 (使用不同的 i7用于多路复用的单独采样的适配器), 以及从步骤2.1.3 中带珠的22µL 的扩展结扎解。注意: Q5 Mastermix 取代了 Illumina 提供的聚合酶 Mastermix。Q5 聚合酶放大的基因片段高保真度和较少引入的错误。 使用以下参数在热循环仪上运行 PCR 程序: 三十年代在98°c, 第4-6 周期十年代在98°c, 三十年代在66°c, 三十年代在72°c;2分钟在72摄氏度, 然后保持在4摄氏度。注意: 周期数取决于面板大小。根据我们的经验, 4 周期 pcr 是足够的, 如果基因组有大约1500不同对基因特异寡核苷酸, 而一个小组与500–600对寡核苷酸需要6周期 pcr。 用磁珠清除 pcr 反应 (材料表, 项目 2): 添加 pcr 反应的磁性珠在改进的 1 pcr 反应: 0.75 磁珠比: 将56.25 µL 的磁珠溶液注入75µL 的 PCR 产物中, 从步骤2.2.2。 将混合物转移到1.5 毫升低结合管。 彻底混合, 吹打至少10次。 让混合物在室温下站立5分钟。 把管子放到磁性支架上。在室温下孵化2分钟或直到上清。 移除上清。 用200µL 70% 乙醇清洗珠子。 孵化三十年代. 去除乙醇。 重复乙醇洗涤步骤一次。 空气干燥的珠子。 洗脱与20µL 的 ddH2O。 使用 QX200 ddPCR 平台量化库。 在方法1中执行步骤1.4。注: 400万分子被规范化每个样品库4在代表性结果 (图 2) 为了获得一个理论平均值7042唯一索引的分子 (400万除以568基因特定寡核苷酸)。 放大和规范化库的排序。 使用以下 mastermix 放大所需的分子数量, 最终 PCR 共计50µL:25 µL Q5 mastermix, 2 µL P5 底漆 (1 µM), 2 µL P7 底漆 (1 µM) 和21µL 的 DNA 分子。 使用以下参数在热循环仪上运行 PCR 程序: 三十年代在98°c;16周期十年代在98°c, 三十年代在66°c, 三十年代在72°c;2分钟在72°c;然后保持在摄氏4摄氏度。 使用磁性珠子清理测序库 (材料表, 项目 2): 在改进的 1 pcr 反应中加入 pcr 反应: 0.75 磁珠比: 吸管37.5 µL 磁珠溶液进入50µL PCR 产品从步骤2.4.2。 将混合物转移到1.5 毫升低结合管。 彻底混合, 吹打至少10次。 让混合物在室温下站立5分钟。 把管子放到磁性支架上。在室温下孵化2分钟或直到上清。 移除上清。 用200µL 70% 乙醇清洗珠子。 孵化三十年代. 去除乙醇。 重复乙醇洗涤步骤一次。 空气干燥的珠子。 洗脱与20µL 的 ddH2O。 在2% 琼脂糖凝胶上运行一个整除的洗脱 DNA (~ 3 µL) 来确认 amplicons 的大小。 量化 DNA 浓度 (材料表, 项目 3) 以确定独立的 ECS 库的浓度。 以摩尔的金额池库。请参阅方法1步1.5.6。还讨论了有关池的更多详细信息。 将汇集的 ECS 库提交大约 4 nM。 向 Illumina 排序平台 (MiSeq、HiSeq 或 NextSeq) 提供以下排序设置: 2×144 配对端读取、8循环索引1和16循环索引2。 生物信息学处理与分析 使用 i7 适配器序列 bioinformatically 使用自定义脚本, 从排序器中获取示例 demultiplexed 读取, 或执行解复用的原始序列读取到不同的示例中。 修剪掉每 demultiplexed 的前30核苷酸, 从基因组中去除寡核苷酸序列。 将共享相同 UMIs 的读取对齐以形成读家庭。注意: 研究人员可以使用 UMI 软件 (如 MAGERI13 ) 来提取读出的家庭。在本实验中, UMI 序列中不允许使用汉明距离来增加方法的特异性。 使用以下推荐参数执行重复数据消除和纠错。 在同一读取系列中使用≥5读对。建议至少三个读对。 比较每个位置上的核苷酸在同一读取的家庭的所有读取, 并产生一个共识核苷酸, 如果有至少90% 的一致性在读取的特定核苷酸。如果核苷酸位置的协议少于 90%, 请拨打 N。 放弃协商一致的阅读, 其中有 > 10% 的协商一致核苷酸总数被称为 N。 使用研究员的首选光刻 (如 Bowtie2 和 BWA) 将所有保留的协商一致阅读本地 hg19 或 hg38 人类参考基因组。 进程对齐读取与 Mpileup 使用参数-BQ0 –d 10兆删除覆盖率阈值, 以确保适当的堆积输出, 而不考虑 VAF。 用少于1000x 的协商一致阅读覆盖率筛选出位置。注: 研究人员任意确定每个核苷酸位置的最小覆盖率, 建议对下游分析至少有500x 的一致阅读覆盖率。 使用二项分布从步骤2.5.7 中的保留数据中调用单核苷酸变体 (SNPs), 并具有以下参数。二项式统计将基于基因组位置特定误差模型。每个基因组的位置在总结出该特定位置的所有样本的错误率后独立建模。下面的示例:在给定基因组位置的核苷酸剖面概率, p∑变种 RF2 ∑总 RFs= 26/255505= 0.00010175924变种 RFs 的二项概率35911总 RFs, P(x ≥ x) 在样品 K= 1 二项式 (24, 35911, 0.000101759)= 2.26485E-13注意: 对于每个基因组位置, 将有三可能的突变变化 (即> T, > C, > G), 每一个将被表示为背景工件。保留 Bonferroni 校正后与背景显著不同的躯体事件。在表 1所示的示例中, 所执行的测试数为 11, 因此需要一个 Bonferroni 更正的p值≤0.00454545 (0.05/11) 来调用事件的统计意义。 体细胞事件需要在两个相同标本的复制中存在;否则, 将其视为误报。 表 1: 示例演示了构造位置特定二项式误差模型的方法。 3. RNA 的错误校正排序 除了对 DNA 水平的突变进行评估外, 还要将 ECS 与各种靶向 rna 测序板集成, 以检测 rna 水平上的稀有或低丰度转录。通过将 ECS 与现成的 Qiagen RNA 测序板结合在一起, 我们展示了数字定量的基因表达的转录, 只有十拷贝, 而不需要规范化的管家基因。错误纠正所需的 UMIs 已集成到面板中。 执行总 RNA 提取 (材料表, 项目 20)。 根据制造商的协议 (材料表, 项目 19) 执行 ECS-RNA 库的准备工作。 根据步骤 2.5, 执行生物信息学管道. 1–2.5. 6。在上一节中概述的方法2。在步2.5.6 以后, 排列的一致的共识的数量在每个基因代表基因的表达水平, 不用基因长度规范化的需要。