Neurodegeneration में प्राथमिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण पूर्व Vivo रैट ब्रेन स्लाइस का उपयोग
Summary
हम एक विधि जो neurodegeneration अंतर्निहित प्रारंभिक घटनाओं में और अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है वर्तमान और स्थापित पूर्व vivo मस्तिष्क तकनीक के आधार पर, vivo में और इन विट्रो प्रयोगों के लाभों के संयोजन । इसके अलावा, यह एक ही संरचनात्मक विमान में इलाज और अनुपचारित समूह की सीधी तुलना के लिए एक अनूठा अवसर का प्रतिनिधित्व करता है ।
Abstract
कई अध्ययनों कि विश्वसनीय पशु मॉडल जो प्राथमिक neurodegeneration अंतर्निहित प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित विकसित करने का प्रयास करने के बावजूद, बहुत कुछ व्यापक रूप से स्वीकार कर लिया गया है । यहां, हम एक नई अच्छी तरह से ज्ञात पूर्व vivo मस्तिष्क टुकड़ा तकनीक है, जो vivo मेंएक करीब प्रदान करता है इन विट्रो की तैयारी की तुलना में परिदृश्य की तरह से अनुकूलित प्रक्रिया का प्रस्ताव है, जल्दी से ट्रिगर घटनाओं की जांच के लिए सेल अध… अल्जाइमर रोग (AD) में मनाया । इस भिंनता सरल और आसानी से reproducible कदम है, जो चयनित मस्तिष्क क्षेत्र और एक शारीरिक वातावरण में अपनी स्थानीय कार्यशीलता के संरचनात्मक cytoarchitecture के संरक्षण को सक्षम करने के होते हैं । विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों एक ही मस्तिष्क से प्राप्त किया जा सकता है, एक साइट में प्रश्न में उपचार के साथ कई प्रयोगों प्रदर्शन करने का अवसर प्रदान-, खुराक, और समय पर निर्भर ढंग से. संभावित सीमाओं जो इस पद्धति से संबंधित परिणामों को प्रभावित कर सकता है ऊतक के संरक्षण से संबंधित हैं, यानी, टुकड़ा करने की क्रिया और मशीन कदम और अनुभाग मोटाई के दौरान अपनी संरचनात्मक अखंडता के रखरखाव, जो जैव रासायनिक और immunohistochemical विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं । इस दृष्टिकोण ऐसे आणविक शारीरिक या रोग की स्थिति, दवा स्क्रीनिंग, या खुराक में शामिल तंत्र की खोज के रूप में विभिंन प्रयोजनों के लिए नियोजित किया जा सकता है, प्रतिक्रिया परख । अंत में, यह प्रोटोकॉल भी व्यवहार अध्ययन में कार्यरत पशुओं की संख्या को कम कर सकता है । आवेदन यहां बताया गया है हाल ही में वर्णित है और पूर्व vivo चूहे मस्तिष्क बेसल forebrain (BF), जो मुख्य रूप से विज्ञापन में प्रभावित क्षेत्रों में से एक है युक्त स्लाइस पर पहली बार के लिए परीक्षण किया गया है । विशेष रूप से, यह दिखा दिया गया है कि एक विषाक्त सी से व्युत्पंन पेप्टाइड के प्रशासन एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ (दर्द) के टर्मिनस की तरह एक विज्ञापन संकेत सकता है प्रोफ़ाइल, ट्रिगर, antero-BF के पीछे धुरी के साथ, के एक अंतर अभिव्यक्ति विज्ञापन में बदल प्रोटीन, जैसे alpha7 कोर्टेक्स रिसेप्टर (α7-nAChR), phosphorylated ताऊ (पी-ताऊ), और amyloid बीटा (Aβ).
Introduction
विज्ञापन एक पुरानी neurodegenerative entorhinal प्रांतस्था (ईसी), BF, हिप्पोकैम्पस (कोर्ट), और घ्राण बल्ब (ओबी)1,2,3के रूप में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों को प्रभावित करने वाली क्रमिक विकृति की विशेषता है,, 4,5. विज्ञापन विकास के एक प्रगतिशील संज्ञानात्मक गिरावट के लिए देर चरणों का नेतृत्व, इस रोग मनोभ्रंश का सबसे आम रूप बनाने, लगभग सभी मामलों के ७०% के लिए लेखांकन6। व्यापक विज्ञापन के कारण प्रारंभिक चरणों को समझने के प्रयास के बावजूद, वहां वर्तमान में एक परिभाषित प्रयोगात्मक संकेत उंहें elucidating नहीं है । इसके अलावा, सबसे लोकप्रिय सिद्धांत-“amyloid परिकल्पना”-तेजी से पूछताछ के बाद से यह विज्ञापन pathobiology समझाने में एक पूर्ण प्रोफ़ाइल प्रदान नहीं करता है, और न ही एक दवा लक्ष्य है कि प्रभावी साबित कर दिया है7,8 ,9.
एक वैकल्पिक सिद्धांत है जो बढ़ रही है ध्यान पता चलता है कि प्रारंभिक neurodegeneration के दौरान होने वाली प्रणाली एक ंयूरॉन क्लस्टर मुख्य रूप से विज्ञापन में अतिसंवेदनशील3,10,11 से संबंधित है , 12 , 13 , 14. इस विषम सेलुलर हब BF के भीतर शामिल, midbrain, और brainstem, इस तरह के चुनाव आयोग, कोर्ट के रूप में कई क्षेत्रों के लिए परियोजनाओं, और ओबी15,16. न्यूरॉन आकृति विज्ञान और न्यूरोट्रांसमीटर संश्लेषण में अपनी विविधता के बावजूद, कोशिकाओं के इस कोर भी एक गैर एंजाइमी समारोह17,18हो सकता है, जो दर्द व्यक्त करने में एक आम सुविधा के शेयरों. यह गैर के रूप में एक-शास्त्रीय भूमिका अणुओं संकेत अणु मध्यस्थता कैल्शियम (ca2 +) न्यूरॉन्स जो पौष्टिकता या विषाक्त घटनाओं से गुजरना कर सकते हैं में प्रवाह के संबंध में ca2 + खुराक, उपलब्धता, और ंयूरॉन आयु17,18 , 19.
neurodegeneration के दौरान, मनाया सेलुलर नुकसान इसलिए इस गैर एंजाइमी समारोह17,18,20, जो एक 30mer पेप्टाइड (T30) के कारण होता है से जुड़े हो सकता है दर्द सी से सट-टर्मिनस 20. पिछले परिणाम के साथ लाइन में, सेल संस्कृति और ऑप्टिकल इमेजिंग18,21 तैयारियों पर किए गए, हम प्रदर्शन, एक उपंयास के माध्यम से पूर्व vivo चूहे दिमाग BF संरचनाओं युक्त स्लाइस के आधार पर दृष्टिकोण, कि T30 प्रेरित एक विज्ञापन जैसा प्रोफ़ाइल22। विशेष रूप से, इस नई पद्धति सेल संस्कृति से एक और अधिक शारीरिक परिदृश्य प्रदान करता है क्योंकि यह एक बरकरार ऊतक की विशेषताओं के कई रखता है, के लिए संरचनात्मक से लेकर सर्किट संरक्षण, हालांकि घंटे की एक समय खिड़की के लिए । हम neurodegeneration के प्रारंभिक चरणों के दौरान जगह लेने की घटनाओं का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल लागू किया, T30 आवेदन पर तीव्र प्रतिक्रिया की निगरानी.
मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करने आणविक क्षति या neurogenesis23,24में गर्भित रास्ते की जांच करने पर साहित्य के बड़े शरीर के बावजूद, इस प्रोटोकॉल पहली बार एक और अधिक तत्काल और संवेदनशील बाहर पढ़ने के लिए प्रदान करता है तुलना organotypic स्लाइस के आम उपयोग करने के लिए । हालांकि, के रूप में organotypic मस्तिष्क वर्गों के लिए मामला है, इस तीव्र टुकड़ा प्रक्रिया भी कई प्रयोजनों के लिए अपनाया जा सकता है, ऐसे न्यूरोप्रोटेक्टिव या neurotoxic अणुओं के मूल्यांकन के रूप में, प्राथमिक आणविक एक विशिष्ट प्रक्रिया में होने वाले परिवर्तनों की खोज, immunohistochemical विश्लेषण, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से संबंधित विकृतियों के लिए औषधीय परख ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के प्रमुख पहलू, अच्छी तरह से स्थापित पूर्व vivo मस्तिष्क तकनीक पर आधारित है, एक विशिष्ट के आवेदन के बाद उनकी प्रतिक्रिया की निगरानी, एक ही संरचनात्मक विमान से प्राप्त दो specular hemislices, तुल्यकालि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम न्यूरो बायो लिमिटेड द्वारा वित्त पोषित किया गया । हम उनकी टिप्पणियों और पांडुलिपि पर सलाह के लिए डॉ Giovanni Ferrati और डॉ सर्जियो रोटोंडो (न्यूरो जैव) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
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