Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

Succès du traitement des métastases de mélanome peut être influencé par la diaphonie entre les cellules tumorales ainsi qu’entre tumeur et les cellules de l’hôte non transformées. Le but de développer des modèles organotypique de cancer in vitro est de fournir des systèmes de test précliniques appropriés qui récapitulent l’organisation 3D et la complexité de mélanome humain in vivo. Ceci permet l’étude des effets thérapeutiques sur la tumeur au sein d’un environnement organotypique et les effets néfastes sur les tissus environnants primaire en parallèle. Pour développer les meilleurs modèles de peau organotypique, la qualité des cellules primaires est cruciale. Il est avantageux d’utiliser juvéniles primaires fibroblastes et des kératinocytes, parce qu’ils sont en général moins différenciés par rapport aux cellules adultes primaire de la peau. La peau juvénile cellules peuvent soit être isolé du prépuce pour mineurs tel que décrit dans les sections du protocole 1-5, mais peut aussi être acheté provenant des compagnies pré-natal primaires fibroblastes et des kératinocytes. Si vous achetez, il est nécessaire aux cellules de l’ordre des différents donateurs afin d’éviter les donateurs axée sur les résultats, par exemple, pour la sensibilité aux médicaments. Le protocole entier s’affiche sous forme de modèle à la Figure 3. Contrôle de la qualité de 3D pleine-peau équivalents nécessite l’analyse immunohistochimique. Une première impression peut être obtenue par l’hématoxyline-éosine (H & E) souillant de paraffine intégrée des sections (3 µm). Une analyse détaillée de la qualité de la différenciation épidermique et de la formation de la couche basale entre le derme et l’épiderme nécessitent analyse immunohistochimiques utilisant des anticorps spécifiques contre un marqueur de stratification épidermique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules indifférenciées, hautement proliférantes situé à proximité de la membrane basale et hautement différenciées et kératinisées de cellules de la couche cornée par le biais de la formation des couches épidermiques distinctes entre les deux . Comme en témoigne la coloration histologique immunitaire (Figure 4), la différenciation des kératinocytes tout au long de l’épiderme était possible similaire à la peau normale : principalement les cellules indifférenciées des couches épidermiques inférieures (strate basale et stratum spinosum) tache positive pour la kératine 14, tandis que les cellules plus différenciées provenant des couches précité-basale (couche granuleuse et la couche cornée) tachent positive pour la kératine 10 et involucrin. En conséquence, le filaggrine coloration pourrait seulement être observée dans des cellules hautement différenciées du stratum corneum. Plus important encore, laminine 5 coloration révèle qu’une lame basale a été générée pour connecter physiologiquement l’épiderme au compartiment dermique de la reconstruction de la peau artificielle. Ce qui prouve qu’un micro-environnement organotypique communicant a été généré pour héberger les cellules de mélanome ou sphéroïdes analyse physiologiques et physiopathologiques. Aux fins de dépistage des drogues mélanome, cellules du mélanome unique peuvent également être intégrés dans le derme des équivalents pleine peau pour permettre de novo mélanome nid formation18,19. Par conséquent, cellules du mélanome sont combinés avec des fibroblastes primaires à un ratio de 5:1, centrifugé ensemble à 200 x g pendant 5 min et resuspendues dans le GNL avant de mélanger avec le collagène. En conséquence, les nids de cellules de mélanome formeront spontanément dans le compartiment par voie cutanée. Selon notre expérience, seules les cellules de la croissance métastatique phase nids de bonne forme, par rapport aux cellules de mélanome du RGP ou VGP15. Un inconvénient majeur de ces types de modèles est le fait que le nombre et la taille des nids de mélanome formé ne peuvent être prédit et peuvent varier entre chaque peau reconstruit, indépendamment de tout traitement. Par exemple, 1 000 cellules ensemencées dans le compartiment par voie cutanée peuvent gagner 10 nids composé de 100 cellules ou 100 nids composé de 10 cellules chaque (Figure 5). Ces variables biologiques présentent trois défauts : tout d’abord, le nombre et la taille des nids de mélanome formé sont imprévisibles ; Deuxièmement, les métastases in vivo sont généralement plus grandes que les nids de mélanome et présentent une diversité intra-tumorale plus complexe ; et Troisièmement, en raison de la durée de vie limitée des modèles de tumeur-nid, traitement est initiée très tôt et par conséquent plutôt inhibe l’excroissance des tumeurs au lieu de provoquer la régression des nids de tumeur existante. Pour surmonter ces modèles limites organotypique mélanome sphéroïde peau peut être généré. Par culture 250 mélanome métastatique des cellules dans un accrochage déposer pendant 14 jours20, sphéroïdes sont générés reproductible consistant en mélanome viable des cellules présentant une structure compacte avec un diamètre final d’environ 500 µm imiter non vascularisés nœuds, micro-métastase ou inter capillaire micro régions de la tumeur de tumeurs solides21,22. En général, une lignée de cellules de mélanome est adaptée pour la génération des sphéroïdes via la pendaison drop méthode ; Cependant, les cellules dérivées de forme de tumeur métastatique stades les plus avancés sphéroïdes plus solides par rapport aux lignées cellulaires dérivées de progression stades précoces, par exemple, le RGP. Pour certaines cellules, il est avantageux pour la formation de sphéroïde appropriée améliorer la viscosité de la pendaison drop de milieu de culture. Ceci peut être réalisé par l’addition de 10 à 50 %-cellulose méthylique au milieu de culture. Pour la solution mère de méthyl-cellulose, cellulose-méthylique de 1,2 g d’autoclave avec une barre magnétique mélanger dans un flacon de verre de 100 mL. Ajouter 100 mL de milieu de préchauffé (60 ° C) et remuez pendant 20 min à température ambiante et un autre 1-2 h à 4 ° C. Centrifuger la solution pendant 2 heures à 5 000 x g et conserver le surnageant visqueux à 4 ° C jusqu’à l’utilisation. Bonne validation de modèles de sphéroïde pleine peau mélanome est fournie par le fait qu’un nombre défini de mélanome sphéroïdes peut – au moins statistiquement – être intégrés dans le fibroblastes/collagène dermique j’ai échafaudage au jour 1 de la construction de modèle de peau, ce qui permet eux pour co-développer au cours de la différenciation épidermique pour plus de 25 à 27 jours. Le rendement des sphéroïdes peut être analysé directement après le semis, car les sphéroïdes apparaissent comme des taches blanches dans le transparent dermiques, gel et peuvent être vu sans n’importe quel dispositif de grossissement (Figure 2). Ainsi, un modèle 3D de la peau est généré que sphéroïdes de mélanome mature de ports, qui avaient été cultivées in vitro pour un total d’environ 42 jours, montrant au plus haut niveau intra tumoraux cellulaire différenciation15. La coloration H & E du modèle peau mélanome sphéroïde révèle l’aspect histologique et la distribution cellulaire des sphéroïdes de mélanome est très semblable à celui de mélanome humain non vascularisé métastases in vivode la peau15 (Figure 6 ). Deux sous-populations de cellules de mélanome sont distingue clairement dans ces conditions : une sous-population périphérique proliférant et une sous-population centrale composé majoritairement de ratatinée, apoptose ou cellules nécrotiques, formant ce qu’on appelle « nécrosées » Centre. Immunohistochimique vivant et multiplient les sous-populations peut être détecté en utilisant des anticorps contre le marqueur de prolifération KI-67, alors que les cellules du centre nécrotique peuvent être visualisés par coloration TUNEL15. Cette répartition particulière des sous-populations de cellules de tumeur est justifiée par la taille de sphéroïde (≥500 µm), résultant d’un manque de nutriments et d’oxygène dans la partie centrale où s’accumulent les déchets catabolique. Selon le protocole fourni ici permettra à la génération d’un organotypique fiable et reproductible modèle de peau humaine de pleine épaisseur avec incorporé des sphéroïdes de mélanome humain qui imitent les métastases de mélanome humain peau. Les applications de ce modèle inclure épreuves, dépistage des toxines, influencent des cosmétiques composés ou thérapie sur l’excroissance des mélanomes et le traitement au laser. Figure 1 : Culture organotypique 3D peau reconstruit submergé avec support et à l’interface air-liquide. Au jour 0 kératinocytes primaires sont ensemencées au-dessus du compartiment cutané consistant en des fibroblastes primaires intégrés dans un collagène de type j’ai matrice. Reconstruit de peau 3D rester cultivés submergés avec EGM pendant 7 jours, se détacher de la paroi de l’insert et début de rétrécissement. Au jour 8 les inserts sont transférés au 6-puits et cultivés à l’interface air-liquide pour permettre de stratification épidermique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Sphéroïdes mélanome incorporés dans le compartiment dermique apparaissent comme des taches blanches. Tout en préparant le compartiment dermique de la reconstruction de peau 3D, un nombre défini de sphéroïdes mélanome peut être ajouté au type fibroblastes collagène que je mélange. Une fois le gel dermique est retombée, sphéroïdes mélanome deviennent visibles sous forme de taches blanches. Figure 3 : Schéma de construction de modèle de peau 3D organotypique. Éliminer le tissu adipeux de l’échantillon de peau et le couper en petits morceaux. L’incubation avec une solution a toute la nuit à 4 ° C facilite la séparation de l’épiderme du derme. Kératinocytes et des fibroblastes primaires isolés devraient être cultivées séparément et utilisées entre passage 4-6 et 3 et 4, respectivement. Par la suite, la génération du modèle 3D de la peau peut procéder comme décrit dans le protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : 3D organotypique peau reconstruit montrent un niveau de différenciation similaire à la peau humaine normale. Sections d’équivalents de peau de paraffine (A) (B) par rapport à la normale sur la peau de l’homme ont été colorés pour l’expression de la kératine 14 (rouge : λex 554 nm, λem 568 nm) et 10, involucrin (vert : λex 490 nm, λem 525 nm ), filaggrine (vert : λex 490 nm, λem 525 nm) et à la laminine 5 (vert : λex 490 nm, λem 525 nm) et analysées avec un microscope confocal fluorescence. Noyaux cellulaires ont été visualisées par coloration au DAPI (bleu : λex 340 nm, λem 488 nm). Examen immunohistochimique de la 3D pleine épaisseur de la peau équivalents révélée correcte épidermiques stratification formant des couches distinctes de l’épiderme, comme on le voit dans la peau humaine normale. Alors que les cellules des couches épidermiques inférieures teint positifs pour la kératine 14, plus des cellules différenciées de la couche basale précité a montré la kératine 10 et involucrin coloration. Cellules hautement différenciées à proximité de la filaggrine stratum corneum exprimé. Coloration de la laminine 5 montre qu’une lame basale est générée pour connecter physiologiquement l’épiderme au compartiment par voie cutanée (panneau le plus bas). Ce chiffre a été pris de Voersmann et al. 15 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Le nombre et la taille des nids de mélanome spontanément formé ne peut pas être prédite. Formation de nid de mélanome de novo dans le compartiment cutanée de pleine peau équivalents peuvent être réalisés en mélangeant un nombre défini de mélanome cellules avec des fibroblastes primaires pour incorporer les deux types de cellules dans le collagène de type I matrice. Le nombre et la taille des nids de mélanome spontanément formé peuvent seulement être analysés d’a reconstruire la peau 3D mature après environ 21 jours. Tel que représenté de deux échantillons (A) et (B), le nombre et la taille de la niche du mélanome peut varier entre chaque peau reconstruit. En conséquence, il est difficile de valider ces modèles et de prédire l’impact thérapeutique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Sphéroïdes mélanome intégrés équivalents peau récapitulent les caractéristiques principales de la métastase de mélanome humain. H & E paraffine coupes des sphéroïdes de tumeur incorporés en équivalents de peau colorées ont révélé des sphéroïdes à partager les caractéristiques principales avec métastases non vascularisé de mélanome cutané humain in vivo. Deux sous-populations de cellules sont clairement perceptibles : une sous-population de vie périphérique et centrale sous-population composé majoritairement de ratatinée, apoptose ou cellules nécrotiques, formant le centre « nécrosé ». Cette répartition des sous-populations de cellules de tumeur est garantie par la taille de sphéroïde. Ce chiffre a été modifié par Voersmann et al. 15 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.