तैयारी और पूरे सेल पैच दबाना के लिए प्रोटोकॉल Xenopus laevis Tectal ंयूरॉंस की रिकॉर्डिंग
Summary
इस पत्र में, हम तीन मस्तिष्क की तैयारी पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल के लिए Xenopus laevis tadpoles के retinotectal सर्किट का अध्ययन चर्चा । प्रत्येक तैयारी, अपने स्वयं के विशिष्ट फायदों के साथ, तंत्रिका सर्किट समारोह के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में Xenopus टैडपोल की प्रयोगात्मक पथ में योगदान देता है ।
Abstract
Xenopus टैडपोल retinotectal सर्किट, आंख में रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGCs) शामिल है जो सीधे synapses ऑप्टिक tectum में न्यूरॉन्स पर फार्म, एक लोकप्रिय मॉडल के लिए अध्ययन कैसे तंत्रिका सर्किट स्वयं इकट्ठा । tectal न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग को पूरा करने और RGC-पैदा प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने की क्षमता, या तो vivo में या एक पूरे मस्तिष्क तैयारी का उपयोग कर, सामान्य अंतर्निहित तंत्र के बारे में उच्च संकल्प डेटा का एक बड़ा शरीर उत्पन्न , और असामान्य, सर्किट गठन और समारोह. यहाँ हम कैसे vivo तैयारी में प्रदर्शन करने के लिए का वर्णन, मूल पूरे मस्तिष्क तैयारी, और एक और अधिक हाल ही में विकसित क्षैतिज मस्तिष्क tectal न्यूरॉन्स से पूरी सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए टुकड़ा तैयारी. प्रत्येक तैयारी अद्वितीय प्रयोगात्मक लाभ है । vivo में तैयारी दृश्य उत्तेजनाओं को आंख पर पेश करने के लिए tectal ंयूरॉंस की प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया की रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है । पूरे मस्तिष्क तैयारी RGC axons के लिए एक उच्च नियंत्रित तरीके से सक्रिय होने के लिए अनुमति देता है, और क्षैतिज मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी tectum के सभी परतों के पार से रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है ।
Introduction
retinotectal सर्किट amphibian दृश्य प्रणाली का प्रमुख घटक है । यह आंख में RGCs, जो ऑप्टिक tectum को अपने axons परियोजना जहां वे postsynaptic tectal ंयूरॉंस के साथ synaptic कनेक्शन फार्म का शामिल है । Xenopus टैडपोल retinotectal सर्किट तंत्रिका सर्किट गठन और समारोह का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय विकासात्मक मॉडल है । इस टैडपोल के retinotectal सर्किट के कई गुण है कि यह एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल1,2,3प्रदान कर रहे हैं । एक प्रमुख विशेषता है, और इस अनुच्छेद के ध्यान, tectal ंयूरॉंस से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग, vivo में या एक पूरे दिमाग की तैयारी का उपयोग करने की क्षमता है । एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग वोल्टेज और वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग मोड का समर्थन करता है कि एक एम्पलीफायर के साथ लगे के साथ, पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक ंयूरॉन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उच्च संकल्प पर विशेषता हो करने के लिए अनुमति देते हैं । नतीजतन, retinotectal सर्किट गठन के प्रमुख चरणों में tectal न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के विकास और आंतरिक4की प्लास्टिक की एक विस्तृत और व्यापक समझ प्रदान की है,5 , ६ , ७ आणि synaptic८,९,१०,११ गुण. पूरे सेल पैच दबाना tectal ंयूरॉन रिकॉर्डिंग, जीन को व्यक्त करने की क्षमता या इन ंयूरॉंस में ब्याज की morpholinos12, और एक विधि के माध्यम से दृश्य निर्देशित व्यवहार का आकलन करने के लिए एक स्थापित दृश्य परिहार परीक्षण13 को बढ़ावा देता है अणुओं के बीच लिंक की पहचान, सर्किट समारोह, और व्यवहार ।
यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि उच्च संकल्प डेटा के प्रकार पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग से प्राप्त संभव आनुवंशिक कैल्शियम संकेतक GCaMP6 के रूप में नए इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग नहीं है, क्योंकि हालांकि कैल्शियम संकेतक का उपयोग इमेजिंग परमिट एक साथ ंयूरॉंस की बड़ी आबादी में कैल्शियम गतिशीलता के, वहां कोई प्रत्यक्ष या स्पष्ट तरीका है कि विशिष्ट बिजली के मापदंडों सोमता में डेल्टा प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, और वहां कोई रास्ता नहीं है वोल्टेज के लिए ंयूरॉन मापने के लिए वर्तमान-वोल्टेज रिश्ते । स्पष्ट रूप से इन दो अलग दृष्टिकोण, electrophysiological रिकॉर्डिंग और कैल्शियम इमेजिंग, गैर अतिव्यापी ताकत के अधिकारी और डेटा के विभिंन प्रकार उत्पंन करते हैं । इस प्रकार, सबसे अच्छा तरीका विशिष्ट प्रयोगात्मक सवाल पर निर्भर करता है संबोधित किया जा रहा है ।
यहां, हम टैडपोल ऑप्टिक tectum के ंयूरॉंस से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए हमारी विधि का वर्णन vivo तैयारी में एक का उपयोग कर, पूरे मस्तिष्क तैयारी, और एक नए संशोधित पूरे मस्तिष्क तैयारी है कि हमारे प्रयोगशाला में विकसित किया गया था14 . प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम प्रत्येक तैयारी के प्रायोगिक लाभ और डेटा के विभिंन प्रकार है कि प्राप्त किया जा सकता है प्रदर्शित करता है । सीमा और विभिंन तैयारियों की ताकत, साथ ही समस्या निवारण के लिए सुझाव, चर्चा अनुभाग में शामिल हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में वर्णित सभी तरीकों विकासात्मक चरण 42 और 49 के बीच tadpoles से tectal न्यूरॉन्स रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं (Neiuwkoop और फेबर15के अनुसार मंचन किया). 42 चरण तक, tadpoles पर्याप्त रूप से बड़े और पर्याप्त ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH ग्रांट SBC COBRE 1P20GM121310-01 द्वारा समर्थित ।
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
Referências
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