De Novo Génération de cellules souches somatiques par YAP/TAZ

Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées adhérant à nos lignes directrices et approuvée par OPBA et le ministère de la santé 1. génération de YAP-induced Mammary cellules souches (yMaSCs) Remarque : Toutes les compositions de médias et de la solution pour la section 1 sont spécifiées dans le tableau 1. Isolement des populations de cellules mammaires primaires Préparer sous une hotte de culture cellulaire : solution hyaluronidase, moyen de dissociation, hémolytique solution, solution triage, Bistouris jetables, collagène, j’ai la solution de revêtement, Ca2 + solution de chélation, lavage moyen #1, lavage moyen #2, solution a, milieu de culture 2D mammaire, de la glace froide HBSS/PS. Pour une expérience typique, sacrifier 10 souris femelles (soit CD-1 de souche C57BL/6), âgés de 8 à 12 semaines par dislocation cervicale. Stériliser l’abdomen avec abondance de solution d’éthanol 70 % avant la dissection. Disséquer la glande mammaire par une incision en forme de Y le long de la peau abdominale et soigneusement séparant les glandes du péritoine en tirant doucement avec une pince Dumont. Placer les glandes disséquées dans un plat de cellules non adhésif avec de la glace 10 mL froid HBSS/PS (20 glandes pour chaque plat), faire attention à ne pas porter sur n’importe quel fragment de peau. Sous une hotte de culture tissulaire, laver chaque glande une fois dans 10 mL de frais HBSS/PS et placez-les dans un plat à adhésif non cellules vide (20 glandes pour chaque plat). Ne pas utiliser des plaques de culture de tissus, cellules auront tendance à s’en tenir à leur causant une perte importante de matériel. Finement hacher les glandes mammaires avec scalpels jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène de fragments de 1 mm3 . Récupérer le tissu haché de chaque plat dans 10 mL de milieu de dissociation avec une pipette sérologique de 25 mL pour éviter l’encrassement et transférer la suspension dans un tube conique de 50 mL, pipetage au moins 5 fois pour désagréger les amas de tissu.Remarque : Pour une digestion efficace, hachage correcte du tissu à l’étape 1.1.5 est crucial. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation vigoureuse continue. Après 1 h, vérifier l’homogénat et prolonger l’incubation en 10 min si les touffes sont toujours présents. Tournez en bas les tissus digérés à 400 x g pendant 5 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot de tissu dans 3 mL de solution hémolytique et incuber pendant 3 min sur la glace.NOTE : Hémolyse est un traitement assez sévère, strict calendrier est donc crucial à cette étape. Laver les cellules avec 10 mL de milieu de lavage #1, tournez en bas les tissus digérés à 400 g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot de tissu dans 10 mL de lavage moyen # 2 et plaque en récipients de culture de tissu de 10 cm. Incuber les plats pendant 1 h à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire.Remarque : Cette étape permet l’élimination de la plupart des fibroblastes, qui doit adhérer à la boîte de Pétri. Récupérer la suspension cellulaire de la vaisselle et les verser dans un tube conique de 50 mL. Tournant à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Laver le culot deux fois dans 10 mL de la Ca2 + solution de chélation par rotation vers le bas à 400 g pendant 5 min à chaque fois. Resuspendre le culot dans 5 mL de 0,25 % trypsine/EDTA et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Ajouter 5 mL de solution a sur le dessus de la solution de trypsine et supplément à la DNase I 1 μg/mL. Pipette et descendre au moins 5 fois par un 1 mL-pointe à désagréger les amas de l’ADN et incuber pendant 10 min à 37 ° C, en secouant toutes les 3 min. Ajouter 10 mL de milieu de lavage #2 et le filtre dans un nouveau tube conique de 50 mL à travers un tamis de cellule 40 μm. Tournez en bas la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant, en veillant à éliminer tout le liquide. Purification de cellules épithéliales mammaires par FACS Préparer le mélange d’anticorps en ajoutant 10 μL Lin (anticorps de lignée de souris cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), à une concentration finale de 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, à une concentration finale de 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, à une concentration finale de 10 ng/mL , 2,5 μL anti-CD29, à une concentration finale de 2,5 ng/mL.Remarque : de cette étape à l’étape 1.3, toujours faire fonctionner dans l’obscurité, afin d’éviter le blanchiment des anticorps fluorescent étiquetés. Pour chaque pellet : Garder un petit nombre de cellules (en plongeant une pointe de 100 μl dans le culot) dans une éprouvette. Remettre en suspension les cellules de 500 μL de solution dans un tube de FACS de tri et de garder sur la glace que l’échantillon non étiqueté pour la procédure de FACS. Resuspendre chaque culot dans 200 μl de milieu de lavage #1, ajouter 44,5 μl du mélange d’anticorps, Pipetter soigneusement et incuber pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité. Diluer la suspension cellulaire dans 10 mL de milieu de lavage #1, tournez en bas à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 2 mL de solution de tri et filtre à travers un bouchon-filtre FACS tubeand passez à FACS-séparation des populations cellulaires (comme dans la Figure 1 b). Avant d’effectuer le protocole de FACS multicolor, veillez à corriger l’effet d’entraînement possible de chaque fluorochrome dans chacune des autres. Pour ce faire, incuber chaque anticorps conjugué fluorophore séparément avec la suspension de cellules et de mesurer les valeurs spectrales chevauchement de fluorochromes et dans tous les détecteurs, par l’intermédiaire de contrôles de simple-couleur, afin de créer une matrice de compensation.Remarque : Dans cette expérience, trieuse équipé 85 μm buse travaillait. Une préparation typique de 10 souris femelles produiront environ 800 000 cellules LD. Procéder à la filtration secondaire si touffes forment au cours de la procédure de FACS. Ensemencement des cellules mammaires primaires de LD Au cours de la procédure de FACS recouvrir une plaque de culture de tissus bien multi avec collagène j’ai solution de revêtement. Incuber pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire. Enlever la solution de revêtement et laver avec du milieu de lavage #1 juste avant. Laver les cellules récupérées de la procédure de FACS avec 10 mL de solution de lavage #1, tournez en bas 400 g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans le milieu de culture 2D mammaire (500 µL/puits) et plaque de collagène traité. Laisser les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant 48 h permettre pour fixation des cellules appropriées et de diffusion.Remarque : Pour un tri typique de 10 souris femelles, 6-8 puits d’une plaque bien multi 24 puits produira une densité cellulaire optimal (100 000 cellules/puits). Induction d’yMaSCs (YAP-induit des cellules souches mammaires)NOTE : D’à partir de cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions de BSL-2. Préparer le milieu colonie mammaire. Fraîchement ajoute la matrice de la membrane basale au milieu, juste avant l’ensemencement de la cellule. Pour l’induction des cellules de tige mammaires induite par YAP (yMaSCs), transmettre les cellules primaires de LD par infection des gènes en mélangeant un volume de FUdeltaGW-rtTA surnageant viral, un volume de surnageant ICMSA-tetO-YAP (ou TAZ), avec deux volumes de mammaires sans sérum Milieu de culture 2D les concentrations de 2 x de suppléments, dans un volume total de 500 mL. Incuber les cellules avec des gènes surnageants pendant 48 h. Pour une préparation des gènes typique, veuillez consulter le protocole en ligne22. Après l’infection, laver les cellules adhérentes et traiter avec mammaire 2D culture additionné à 2 doxycycline µg/mL pour induire l’expression de gène exogène YAP (ou TAZ). Utiliser des cellules infectées par le vide, vecteurs exprimant EGFP ou YAPS94A ou les cellules infectées par des vecteurs inductibles de YAP (ou TAZ), mais laissées sans doxycycline comme témoins négatifs.NOTE : Infection réussie peut être validée par qRT-PCR avec des amorces spécifiques pour homme YAP transgène, comme précédemment décrit1. Après 7 jours d’induction avec la doxycycline, détacher les cellules adhérentes par incubation avec 0.05 % trypsine/EDTA (150 μl/puits) pendant 10 min à 37 ° C ; Arrêtez la trypsinisation en dilution 1:5 dans le milieu de lavage #2 (600 μL/puits) et compter les cellules. Remettre en suspension les cellules dans le milieu de la colonie mammaires (1 mL pour chaque puits), additionnés de 2 μg/mL doxycycline et la semence à une densité de clonogénique de 1 000 cellules/puits dans les plaques de fixation ultra basse 24 puits.Remarque : Assurez-vous que le support de la colonie mammaire est glacé au moment de l’addition de matrice de membrane basale. La matrice de la membrane basale doit être conservée à-20 ° C à l’arrivée et décongelée lentement à 4 ° C durant la nuit ; une fois décongelé, il doit toujours être manipulé sur la glace, conformément aux directives du fabricant. Une fois YAP-exprimant les cellules LD commencent à proliférer et se développer comme colonies MaSC-comme en suspension (colonies d’yMaSC) (14 jours après le semis), comte et traiter pour poursuivre l’analyse (Figure 1).Remarque : Les cellules de contrôle négatif (comme dans le point 1.4.3) restera comme cellules individuelles. Reconstituer la culture avec un milieu colonie mammaires frais toutes les 72 h durant les 14 jours de croissance des colonies yMaSC ; pour ce faire préparer une partie aliquote du milieu de la colonie mammaires sans membrane basale 5 % matrice, additionné de concentration 10 x de suppléments et ajouter 01:10 du volume total dans chaque puits (par ex. 100 μL dans 1 mL de milieu total), afin d’éviter une dilution excessive de la suspension de la matrice. Sub culture d’yMaSCs Récupérer les colonies primaires du milieu colonie mammaires, puis se dissocient et réamorcez.Remarque : yMaSC colonies issues de cellules YAP-reprogrammé LD acquièrent la capacité d’auto-renouvellement et peuvent être avec succès sous – cultivées sans une administration de doxycycline (c’est-à-dire, indépendamment de l’expression des transgénique YAP/TAZ) plus loin. Préparer, sous une hotte de culture cellulaire, milieu de la colonie mammaires comme au point 1.4.1 et mammaires organoïde milieu. Collecter chaque échantillon et incuber dans l’excès de volume (10:1) de la glace froide HBSS pendant 1 h sur la glace, afin de solubiliser la matrice de la membrane basale. Laver les colonies 3 x par centrifugation à 180 x g pendant 5 min et remettre dans la glace froide HBSS. Incuber les colonies à 0.05 % trypsine/EDTA pendant 10 min à 37 ° C pour obtenir une suspension monocellulaire. Colonies de pipette et descendre de 10 x avec une pointe de p1000 pour assurer une dissociation complète au niveau de la cellule unique. Comte et réensemencer les cellules dans le milieu de la colonie mammaires (1 mL pour chaque puits) sans la doxycycline à une densité de clonogénique de 1 000 cellules/puits dans les plaques de fixation ultra basse 24 puits. Répétez ce passage procédure tous les 10-14 jours pour évaluer l’auto-renouvellement. Avant le troisième passage, passage yMaSC colonies en conditions de culture organoïde, afin d’améliorer yMaSC expansion et pour permettre la formation de mini-glandes, qui s’organiser dans un épithélium double étroitement réminiscent de la glande en vivo Organisation histologique. Récupérez les colonies depuis le milieu de la colonie mammaires comme au point 1.5.3 à 1.5.4. Colonies de remettre au facteur de croissance de 100 % réduit la matrice de la membrane basale, considérant à replate un maximum de 20-25 colonies pour chaque puits d’une plaque de fixation ultra basse 24 puits dans 150 µL de la matrice. Incuber les boîtes dans un incubateur de culture cellulaire pendant 40 min à 37 ° C et laissez la matrice de la membrane basale se solidifier et ensuite superposer les gels avec 500 μl de milieu organoïde mammaire. Après quelques jours, vérifier pour la formation de colonies pour former en herbe organoïdes (Figure 1E). Après 10-14 jours, passage ou processus l’organoïdes pour une analyse ultérieure. Au passage organoïdes cultures, récupérer organoïdes en recueillant chaque échantillon et d’incubation dans un volume excessif (10:1) de la glace froide HBSS pendant 1 h sur la glace, afin de solubiliser la matrice de la membrane basale. Laver organoïdes 3 x par rotation vers le bas à 180 x g pendant 5 min et remettre en suspension dans la glace froide HBSS. Incuber organoïdes à 0.05 % trypsine/EDTA pendant 10 min à 37 ° C pour obtenir une suspension monocellulaire. Pipette organoïdes haut en bas 10 x avec une pointe de p1000 pour assurer une dissociation complète au niveau de la cellule unique. Réamorcez sous forme de suspension monocellulaire dans une goutte de matrice réduite membrane basale de facteur de croissance de 100 % (150 μL de chaque puits d’une plaque de fixation ultra basse 24 puits). Laissez la matrice de la membrane basale forment un gel en incubant 40 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire et superposer les gels avec 500 μl de milieu organoïde mammaire.Remarque : yMaSC organoïdes peut être cryoconservés en récupérant de la culture de matrice de membrane basale de 100 % comme au point 1.5.13, évitant la trypsinisation. Stocker dans le mammaires organoïde additionné de 10 % DMSO. Congeler rapidement l’organoïdes yMaSC à-80 ° C et ensuite conservés dans l’azote liquide. 2. génération d’yDucts Remarque : Toutes les compositions de médias et de la solution au chapitre 2 sont indiquées au tableau 2. Isolement des acini pancréatiques primaires Placer les ciseaux et pinces de dissection dans 70 % EtOH et préparer sous un hotte acineuses culture milieu de culture cellulaire, 15 mL pour chaque souris ; support de récupération acineuses, 60 mL pour chaque souris ; PBS/PS ; collagénase de solution mère j’ai ; collagénase j’ai solution A, 15 mL pour chaque souris ; neutralisé queue-de-rat collagène j’ai solution. Neutraliser le collagène de queue de rat I à pH = 7, en réglant d’abord avec NaOH 0,1 N à l’acide acétique dans laquelle le collagène se dissout, puis avec 10N HCl. diluer à 2,5 mg/mL de tampon en PBS/PS garder le collagène de queue de Rat I et tous les réactifs sur la glace pour le neutraliser. Sacrifier 6 à 9 semaines-vieille souris du génotype adéquat. Placez chaque souris sur son dos et laver l’abdomen avec une solution d’éthanol à 70 %. Faire une incision longitudinale le long de la paroi abdominale. Localiser et disséquer le pancréas (en utilisant la rate comme guide) et le placer dans un plat adhésif non cellules de 10 cm dans la glace de 10 mL PBS/PS-transfert froid les plats immédiatement sous une hotte de culture de cellules. Travailler toujours de partir de cette étape, sous une hotte de culture cellulaire. Transférer chaque pancréas dans une nouvelle cellule non adhésif plat précédemment rempli de 7 mL de collagénase j’ai solution A. Rapidement, émincer chaque pancréas avec une paire de Bistouris jetables, pour obtenir une suspension homogène de tissu de fragments de3 environ 1 mm.Remarque : Il est important de noter que cette procédure devrait prendre pas plus de 2 min pour la viabilité cellulaire optimal. Incuber le plat pour la digestion de collagénase à 37 ° C, 5 % de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire pendant 10 min, secouant toutes les 3 min pour assurer la digestion de tissu homogène. Récupérer les tissus digérés dans un tube conique de 50 mL (un pour chaque pancréas), laver le plat avec 10 mL de milieu de lavage acineuses et placez-le dans le même tube conique de 50 mL, pipetage digéré tissu haut et bas pas plus de 3 x. Tournez en bas les tissus digérés pendant 5 min à 100 g à 18 ° C et éliminer le surnageant.Remarque : Tournez en bas les cellules à 18 ° C pour réduire l’activité de la collagénase au cours de cette étape. Resuspendre le tissu pellet dans 7 mL de collagénase j’ai solution A et verser cette solution dans une autre boite de colle de cellules non 10 cm. Incuber le plat pour une deuxième série de digestion de collagénase à 37 ° C pendant 10 min comme au point 2.1.5, secouant toutes les 3 min pour assurer la digestion de tissu homogène. Pendant ce temps, préparer un tube conique propre 50 mL pour chaque pancréas surmonté d’une crépine de cellule 100 μm. Récupérer les tissus digérés et passer à travers la crépine de cellule de 100 μm par macération des tissus avec un piston de seringue stérile de 10 mL (veillez à enfoncer avec soin le tissu, évitant les forces de cisaillement tangent à la surface du tamis). Laver le plat avec 10 mL de milieu de lavage acineuses et traverser ce 10 mL de la crépine de cellule μm 100 même. Tournez en bas les tissus digérés pendant 5 min à 100 g à 18 ° C et éliminer le surnageant. Récupérer la pastille de tissu avec 10 mL de milieu de lavage acineuses. Transférer la solution de cellules dans un tube conique de 50 mL contenant supplémentaire 10 mL de milieu de lavage acineuses frais déjà, en évitant pipetage excessive pour la remise en suspension de la pastille. Tournez en bas les tissus digérés pendant 5 min à 100 g à 18 ° C et éliminer le surnageant. Soigneusement Resuspendre les tissus digérés dans 6 mL de milieu de récupération acineuses et distribuez-le dans les 2 puits de 6 puits multi bien vitroplants plaque, 3 mL chacun. Sous un stéréomicroscope soigneusement évaluer la qualité de l’isolement acineuse, qui apparaissent sous forme d’une suspension homogène de clusters acineuses, avec une faible proportion de cellules uniques (voir la Figure 2 b) ; supprimer n’importe quel tissu gros amas éventuellement présent (généralement visible à le œil nu), par pipetage eux hors de la solution. Ensemencement des acini pancréatiques primaires Incuber les clusters acineuses digérées à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire pendant 2 h, pour permettre la récupération de la cellule. Dans cette couche de récupération cellule multi 48 puits puits avec 100 μL de collagène neutralisée rat queue j’ai et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire pour permettre un coussin d’hydrogel pour former. Après 2 h de récupération de la cellule, recueillir la suspension de cellules acineuses dans un tube à fond conique, tournez vers le bas pendant 5 min à 100 g à 18 ° C et éliminer le surnageant. Remettre en suspension les acini dans le volume approprié de milieu de culture acineuse (150 μL à chaque puits d’une plaque de culture de tissus bien 48). Semences chaque dissociés du pancréas en 16 puits afin d’obtenir une densité optimale (100-120 acineuses grappes/puits). Diluer cette suspension acinaire avec un volume égal de collagène de queue de rat neutralisée j’ai solution, garder les tubes sur la glace. Mélanger soigneusement et rapidement des graines la suspension cellulaire sur le coussin de collagène décrit à la section 2.2.2 (300 μl à chaque puits d’une plaque de culture de tissus bien multi bien 48). Incuber 1 h à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire pour permettre un hydrogel pour former. Induction d’organoïdes pancréatique Superposition des hydrogels de collagène avec 500 μL d’acineuses Culture additionné à 2 doxycycline μg/ml pour l’induction de YAP dépendant du pancréas organoïdes de R26-rtTAM2 ; TetO-YAPS127A souris ; contrôles négatifs sont fournis par wt cellules cultivées dans les mêmes conditions ou R26-rtTAM2 ; TetO-YAPS127A cellules cultivées en absence de doxycycline. Cellules acineuses de culture dans le milieu de Culture acineuses additionné de 2 doxycycline μg/mL pendant 5 à 7 jours rafraîchissant de milieu de culture (300 μL/puits) toutes les 48 h et après formation organoïde par des changements morphologiques vers kyste formant des structures ressemblant à des canalaire ( Figure 2). Une fois que les organoids se forment, cellules peuvent être repiquées dans des conditions de culture organoïde pancréatique ou récoltés pour approfondir les analyses (par exemple: extraction de l’ARN, immunofluorescence). Sub culture d’organoïdes pancréatique Afin d’évaluer leur capacité d’autorenouvellement, par clonage passage organoïdes pancréatiques induite par YAP (yDucts) dans la membrane de sous-sol en trois dimensions matrice hydrogels (conditions de culture organoïde pancréatique) indépendamment l’apport exogène de YAP/TAZ (i.e. indépendamment de l’administration doxycycline). Préparer la trypsine 0,05%/EDTA ; matrice de facteur de croissance de 100 % de réduction membrane basale ; Pancréatique organoïde Medium et collagénase j’ai solution B. Préparer un 15 mL conique tube avec 4 mL de collagénase, j’ai la solution B pour chaque puits être repiquées. Jeter le milieu de culture, soigneusement extrait des puits hydrogels en aspirant doucement et transférez-les sur les tubes coniques. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 30 min, avec une agitation vigoureuse continu pour permettre une digestion complète de la matrice de collagène (cocher toutes les 10 min jusqu’à ce que l’hydrogel est complètement solubilisé). Tournez en bas des cellules récupérées à 750 g pendant 2 min et éliminer le surnageant. Incuber les cellules récupérées dans 1 mL de trypsine 0,05%/EDTA pendant 10 min à 37 ° C pour obtenir une suspension monocellulaire. Diluer la trypsine avec 9 mL de PBS 1 x, tournez en bas à 750 g pendant 2 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans la matrice de glace froide facteur de croissance réduite de membrane basale et semences dans des plaques de fixation ultra faible (généralement une baisse de 150 μL dans un puits d’une plaque 24 puits). Laisser la membrane basale matrice hydrogel se solidifient en incubant les plaques dans un incubateur de culture cellulaire 40 min à 37 ° C et ensuite overlay avec pancréatique organoïde moyen (500 μl à chaque puits). yDucts se développera comme kyste-comme organoïdes en 7-10 jours (Figure 2D). Pour le passage plus organoïdes peut être retiré de la matrice de la membrane basale par incubation dans le froid glace PBS 1 x pendant 30 min, ensuite laver 3 fois par rotation à 180 x g pendant 5 min et remise en suspension dans du PBS froid glace 1 x afin d’éviter le report de la matrice. Organoïdes sont alors dissociées avec la trypsine 0.05 % pendant 10 min obtenir une suspension de cellules individuelles et redéfinies dans la matrice de la membrane de sous-sol frais et puis recouvert le pancréas organoïde moyen (comme dans 2.4.7-2.4.8). yDuct organoïdes peut être cryoconservés dans l’azote liquide en récupérant de membrane basale 100 % culture de matrice comme à l’étape 2.4.9, évitant la trypsinisation, et stocker dans un milieu organoïde pancréatique additionné de 10 % DMSO. yDuct organoïdes sont rapidement congelés à-80 ° c et ensuite conservés dans l’azote liquide.