DOVO Generatie van somatische stamcellen door YAP/TAZ

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd vast te houden aan onze institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de OPBA en het ministerie van volksgezondheid 1. generatie van YAP-geïnduceerde Mammary stam-achtige cellen (yMaSCs) Opmerking: Alle composities van de media en oplossing voor sectie 1 worden gespecificeerd in tabel 1. Isolatie van primaire borstklier cel populaties Bereiden onder de motorkap van een cel cultuur: wegwerp scalpels hyaluronidase oplossing, dissociatie medium, hemolytische oplossing, Sorteer oplossing, collageen ik coating oplossing, Ca2 + drogen oplossing, wassen medium #1, wassen middellange #2, dispase de oplossing, borstklier 2D kweekmedium, ijs koud HBSS/Psalm Voor een typisch experiment, offeren 10 vrouwelijke muizen (ofwel CD-1 van C57BL/6 stam), 8-12 weken oud door cervicale dislocatie. Het steriliseren van de buik met overvloedige 70% ethanol oplossing vóór dissectie. Ontleden de borstklieren door het maken van een Y-vormige incisie langs de buikhuid en zorgvuldig het scheiden van de klieren van het buikvlies door zachtjes te trekken met een Dumont Tang. Plaats de ontleed klieren in een niet-cel zelfklevende schotel met 10 mL ijs koud HBSS/PS (20 klieren voor elk gerecht), om ervoor te zorgen niet te voeren over een fragment van de huid. Onder de motorkap van een weefselkweek, wassen elke klier eenmaal in 10 mL verse HBSS/PS en plaats ze in een lege niet-cel zelfklevende schotel (20 klieren voor elk gerecht). Gebruik geen weefselkweek platen, aangezien de cellen de neiging vast te houden aan hen veroorzaakt aanzienlijk verlies aan materiaal. Fijn blad voor de borstklieren met scalpels totdat een homogene mengeling van 1 mm3 fragmenten wordt verkregen. Het gehakt weefsel herstellen van elk gerecht in 10 mL dissociatie medium met een precisiepipet 25 mL serologische te voorkomen verstopping en spoel de suspensie in een conische tube van 50 mL pipetteren minstens 5 x gedesag weefsel klontjes.Opmerking: Voor een efficiënte spijsvertering, goede hakken van het weefsel in stap 1.1.5 is van cruciaal belang. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met continue krachtig schudden. Na 1 h, Controleer het homogenaat en incubatie verlengen door 10 min als klontjes nog steeds aanwezig zijn. Spin down het verteerd weefsel bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 3 mL hemolytische oplossing en incubeer 3 min op ijs.Opmerking: Hemolyse is een vrij agressieve behandeling, dus strikte timing is van cruciaal belang bij deze stap. Cellen met 10 mL van wassen medium #1 wassen, spin down het verteerd weefsel bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 10 mL van de wash medium # 2 en plaat in 10 cm weefselkweek gerechten. Incubeer de gerechten gedurende 1 uur bij 37 ° C in een cel cultuur incubator.Opmerking: Deze stap kan verwijdering van de meerderheid van de fibroblasten, die aan de cultuur-schotel voldoen moet. Herstellen van de celsuspensie van de gerechten en giet in een conische tube van 50 mL. Draai bij 400 x g gedurende 5 min en elimineren van de bovendrijvende substantie. De pellet in 10 mL van de Ca2 + chelaat oplossing door spinnen neer bij 400 x g gedurende 5 min telkens twee keer wassen. Resuspendeer de pellet in 5 mL 0,25% trypsine/EDTA en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Voeg 5 mL van de oplossing van de dispase op de bovenkant van de trypsine-oplossing en aan te vullen met DNase ik 1μg/mL. Pipetteer op en neer ten minste 5 x via een 1 mL-tip gedesag DNA klontjes en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C, iedere 3 minuten te schudden. 10 mL van wassen medium #2 en filter in een nieuwe conische tube van 50 mL toevoegen door een 40 μm cel zeef. Spin down de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant, ervoor zorgend om al vloeistof te elimineren. Zuivering van de borstklier epitheliale cellen door FACS Voorbereiden van de antilichaam-mix door toevoeging van 10 μL Lin (muis lineage antilichaam cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), om een eindconcentratie van 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, om een eindconcentratie van 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, om een eindconcentratie van 10 ng/mL , 2.5 μL anti-CD29, om een eindconcentratie van 2,5 ng/mL.Opmerking: van deze stap voor stap 1.3, altijd werken in het donker, om te voorkomen dat bleken van de fluorescently gelabelde antilichamen. Voor elke pellet: Houd een klein aantal cellen (door dompelen een 100 μl tip in de pellet) in een aparte buis. Resuspendeer de cellen in 500 μL van de oplossing in een buis FACS sorteren en houd op ijs als het labelloze monster voor de FACS procedure. Resuspendeer elke pellet in 200 μL van wassen medium #1, 44,5 μL van antilichaam mix toevoegen, Pipetteer grondig en incubeer gedurende 30 min op ijs in het donker. Verdun de celsuspensie 10 ml van wassen medium #1, spin down bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 2 mL oplossing sorteren en filteren door middel van een GLB-zeef FACS tubeand overgaan tot FACS-scheiding van de bevolking van de cel (zoals in figuur 1B). Voordat u het multicolor FACS-protocol uitvoert, ervoor om te corrigeren voor de mogelijke spillover van elke fluorescerende in elk van de anderen. Om dit te doen, elke fluorophore-geconjugeerde antilichaam afzonderlijk met de celsuspensie broeden en meten van spectrale overlap waarden voor alle fluorophores en in alle detectoren, via één kleur controles, om een compensatie-matrix maken.Opmerking: In dit experiment, diasorteerderweergave uitgerust met 85 μm mondstuk werkte. Een typische bereiding op basis van 10 vrouwelijke muizen zal opleveren ongeveer 800.000 LD cellen. Ga verder naar secundaire filtratie als bosjes tijdens FACS procedure vormen. Zaaien van primaire borstklier LD cellen Tijdens de procedure FACS jas een multi goed weefselkweek plaat met collageen ik coating oplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2 in een cel cultuur incubator. Verwijder de coating-oplossing en wassen met wash medium #1 net voordat plating. Wassen cellen verhaald FACS procedure met 10 mL wassen oplossing #1, spin down 400 x g gedurende 5 minuten en elimineren van de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de pellet van de cel in de borstklier 2D kweekmedium (500 µL per putje) en collageen behandeld plaat. Laat de cellen zitten in een cel cultuur incubator voor 48 uur te voorzien van de juiste cel gehechtheid en verspreiden.Opmerking: Voor een typische sortering van 10 vrouwelijke muizen, 6-8 putjes van een 24-well multi goed plaat zal opleveren een optimale celdichtheid (100 000 cellen per putje). Inductie van yMaSCs (borstklier stamcellen YAP-geïnduceerde)Opmerking: Vanaf deze stap verder, alle procedures moeten worden uitgevoerd onder BSL-2 voorwaarden. Bereiden borstklier kolonie medium. Vers de kelder membraan matrix aan het medium toevoegen net voor het zaaien van de cel. Voor de inductie van YAP-geïnduceerde borstklier stamcellen (yMaSCs), transduce de primaire LD cellen door lentivirale infectie door het mengen van een volume van virale supernatans dat FUdeltaGW-rtTA, één volume van het supernatans dat FUW-tetO-YAP (of TAZ), met twee volumes van borstklieren serumvrij 2D kweekmedium 2 x concentraties van supplementen, in een totaal volume van 500 mL. Incubeer de cellen met lentivirale supernatant gedurende 48 uur. Raadpleeg de on line protocol22voor een typische lentivirale preparaat. Na infectie, wassen Adherente cellen en behandelen met borstklier 2D kweekmedium aangevuld met 2 µg/mL doxycycline voor het opwekken van exogene YAP (of TAZ) genexpressie. Gebruik cellen geïnfecteerd met lege, EGFP of YAPS94A waarin vectoren of cellen besmet met afleidbare YAP (of TAZ) vectoren, maar links zonder doxycycline als negatieve controles.Opmerking: Succesvolle infectie kan worden gevalideerd door qRT-PCR met primers specifiek voor mens YAP transgenic, als eerder beschreven1. Na 7 dagen van inductie met doxycycline, loskoppelen Adherente cellen door incubatie met 0,05% trypsine/EDTA (150 μl per putje) gedurende 10 minuten bij 37 ° C; Stop trypsinebehandeling door verdunning 1:5 in wassen normaal #2 (600 μl per putje) en cellen tellen. Resuspendeer de cellen in het medium van de borstklier kolonie (1 mL voor elk putje), aangevuld met 2 μg/mL doxycycline en zaad bij een dichtheid van de clonogenic van 1000 cellen per putje in 24-well ultralow bijlage platen.Opmerking: Zorg ervoor dat het medium van de borstklier kolonie ijskoud op het moment van matrixoptelling kelder membraan. De kelder membraan matrix moet altijd worden opgeslagen bij-20 ° C bij aankomst, en ontdooid langzaam bij 4 ° C’s nachts; eenmaal ontdooid, moet het altijd worden behandeld op het ijs, volgens de richtlijnen van de fabrikant. Eenmaal YAP-uiten LD cellen beginnen prolifererende en groeien als MaSC-achtige kolonies in suspensie (yMaSC kolonies) (14 dagen na het zaaien), tellen en verwerken voor verdere analyse (Figuur 1 c).Opmerking: Negatieve controle cellen (zoals in punt 1.4.3) blijft als afzonderlijke cellen. Vullen van de cultuur met verse borstklier kolonie Medium elke 72 h tijdens de 14 dagen van de groei van de kolonie van de yMaSC; om dit te doen een aliquoot gedeelte van de borstklier kolonie medium zonder 5% kelder membraan matrix, aangevuld met 10 x concentratie van supplementen voor te bereiden en het toevoegen van 1:10 van het totale volume aan elk putje (bv 100 μl in 1 mL totale voedingsbodem), om te voorkomen dat buitensporige verdunning van de schorsing van de matrix. Sub kweken van yMaSCs Herstellen van de primaire kolonies van het medium van de borstklier kolonie, dan distantiëren en reseed.Opmerking: yMaSC kolonies afgeleid van YAP-geherprogrammeerd LD cellen verwerven van zelf-vernieuwing capaciteit en kunnen met succes sub gekweekte zonder verdere doxycycline administratie (dwz, onafhankelijk van de expressie van transgene YAP/TAZ). Bereiden, onder de motorkap van een cel cultuur, borstklieren kolonie medium zoals in stap 1.4.1 en borstklieren organoid medium. Elk monster verzameld en broeden in de overtollige hoeveelheid (10:1) ijs koud HBSS gedurende 1 uur op het ijs, om de solubilize van de kelder membraan-matrix. Wassen van de kolonies 3 x door centrifugatie bij 180 x g gedurende 5 min en resuspendeer in ijs koud HBSS. Incubeer kolonies in 0.05% trypsine/EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Pipetteer kolonies op en neer 10 x met een p1000 tip om ervoor te zorgen volledige dissociatie tot één celniveau. Graaf en reseed cellen in het medium (1 mL voor elk putje) van de borstklier kolonie zonder doxycycline bij een dichtheid van de clonogenic van 1000 cellen per putje in 24-well ultralow bijlage platen. Herhaal deze procedure elke 10-14 dagen passaging om te beoordelen zelf-vernieuwing. Voor de derde passage, passage yMaSC kolonies in organoid kweekomstandigheden, ter verbetering van de yMaSC uitbreiding en te voorzien in de vorming van mini-klieren, die zichzelf in een bilayered epitheel nauw die doet denken aan de melkklier in vivo organiseren histologische organisatie. Herstellen kolonies van de borstklier kolonie medium zoals in stap 1.5.3 tot 1.5.4. Resuspendeer kolonies in 100% groeifactor verminderd de kelder membraan matrix, overwegen om een maximum van 20-25 kolonies voor elk putje van de plaat van een 24-well ultralow bijlage in 150 µL van de matrix replate. Incubeer de platen in een cel cultuur incubator voor 40 minuten bij 37 ° C en laat de kelder membraan matrix stollen en vervolgens bedekken de gels met 500 μL van de borstklier organoid medium. Controleer na een paar dagen voor de vorming van de kolonies naar formulier ontluikende organoids (figuur 1E). Na 10-14 dagen, passage of proces de organoids voor verdere analyse. Passage organoids culturen, organoids herstellen door het verzamelen van elk monster en broeden in overtollige hoeveelheid (10:1) ijs koud HBSS gedurende 1 uur op het ijs, om de solubilize van de kelder membraan-matrix. Wassen van organoids 3 x door spin down bij 180 x g gedurende 5 min en resuspendeer in ijs koud HBSS. Incubeer organoids in 0.05% trypsine/EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Pipetteer organoids op en neer 10 x met een p1000 tip om ervoor te zorgen volledige dissociatie tot één celniveau. Reseed als de schorsing van een eencellige in een daling van 100% groeifactor verminderde kelder membraan matrix (150 μl voor elk putje van de plaat van een 24-well ultralow bijlage). Laat de kelder membraan matrix een gel te vormen door het broeden van 40 minuten bij 37 ° C in een cel cultuur incubator en bedekken de gels met 500 μL van de borstklier organoid medium.Opmerking: yMaSC organoids kan worden cryopreserved door herstellende is van 100% kelder membraan matrix cultuur zoals in stap 1.5.13, het vermijden van trypsinebehandeling. Opslaan in het medium van de borstklier organoid aangevuld met 10% DMSO. Snel bevriezen de yMaSC organoids bij-80 ° C en vervolgens in vloeibare stikstof wordt bewaard. 2. productie van yDucts Opmerking: Alle composities van de media en oplossing voor sectie 2 worden gespecificeerd in tabel 2. Isolatie van primaire alvleesklier acini Plaats dissectie Tang en schaar in 70% EtOH en bereiden onder een cel cultuur kap acinaire kweekmedium, 15 mL voor elke muis; acinaire herstel medium, 60 mL voor elke muis; PBS/PS; stockoplossing collagenase I; Collagenase ik oplossing A, 15 mL voor elke muis; staart van de rat collageen geneutraliseerd ik oplossing. Neutraliseren van rat staart collageen I bij pH = 7, door eerst aanpassen met 0,1 N NaOH buffer van het azijnzuur in die de collageen wordt ontbonden, en daarna bij 10N HCl. Dilute tot 2,5 mg/mL in PBS/PS. houden de Rat staart collageen ik en alle reagentia op ijs te neutraliseren. 6 tot 9 weken oude muizen van het juiste genotype te offeren. Plaats elke muis op zijn rug, en wassen van de buik met 70% ethanol oplossing. Een longitudinale incisie langs de buikwand te maken. Zoeken en ontleden van de alvleesklier (met behulp van de milt als een gids) en plaats het in een 10 cm niet-cel zelfklevende schotel in 10 mL ijs koud PBS/PS. Transfer de gerechten onmiddellijk onder de motorkap van een cel cultuur. Vanaf deze stap, werken altijd onder de motorkap van een cel cultuur. Overdracht van elke alvleesklier in een nieuwe niet-cel zelfklevende schotel eerder gevuld met 7 mL collagenase ik oplossing A. Snel blad voor elke alvleesklier met een paar wegwerp scalpels, te verkrijgen van de opschorting van een homogene weefsel van ongeveer 1 mm3 fragmenten.Opmerking: Het is belangrijk op te merken dat deze procedure niet meer dan 2 min voor de levensvatbaarheid van de optimale cellen moet nemen. Incubeer de schotel voor collagenase vertering bij 37 ° C, 5% CO2 in een cel cultuur incubator voor 10 min., iedere 3 minuten om te verzekeren van homogene weefsel spijsvertering schudden. Herstellen van het verteerd weefsel in een conische tube van 50 mL (één voor elke alvleesklier), wassen van de schotel met 10 mL acinaire Wash Medium en plaatst u deze in de dezelfde conische tube van 50 mL, pipetting verteerd weefsel op en neer niet meer dan 3 x. Spin down het verteerd weefsel gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 18 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie.Opmerking: Spin down de cellen bij 18 ° C tot lagere collagenase activiteit tijdens deze stap. Resuspendeer de weefsel pellet in 7 mL collagenase ik oplossing A en giet deze oplossing in een nieuwe 10 cm niet-cel zelfklevende schotel. Incubeer de schotel voor een tweede ronde van collagenase spijsvertering bij 37 ° C gedurende 10 minuten zoals in stap 2.1.5, schudden elke 3 min om homogene weefsel spijsvertering verzekeren. In de tussentijd bereiden een schone 50 mL conische buis voor elke alvleesklier gegarneerd met een 100 μm cel zeef. Het verteerd weefsel herstellen en de 100 μm cel zeef passeren door de macerating van het weefsel met een steriele 10 mL spuit zuiger (zorg ervoor dat u zorgvuldig druk naar beneden van het weefsel, vermijden van shear krachten tangentieel op het oppervlak van de zeef). Wassen van de schotel met 10 mL van acinaire wassen medium, en dit 10 mL passeren de dezelfde 100 μm cel zeef. Spin down het verteerd weefsel gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 18 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie. Herstellen van de pellet met 10 mL van acinaire wassen medium. Breng de oplossing van de cel in een conische tube van 50 mL al die extra 10 mL verse acinaire wassen medium, het vermijden van buitensporige pipetteren voor resuspensie van de pellet. Spin down het verteerd weefsel gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 18 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie. Zorgvuldig resuspendeer de verteerd weefsel in 6 mL acinaire herstel voedingsbodem en verdelen in 2 putten van elk 3 mL 6-well multi goed weefselkweek plaat. Onder een stereomicroscoop zorgvuldig beoordelen de kwaliteit van de acinaire isolatie, die worden weergegeven als een homogene suspensie van acinaire clusters, met een kleine deel van afzonderlijke cellen (Zie figuur 2B); verwijderen van een grote weefsel bosjes uiteindelijk presenteren (meestal zichtbaar ook met het blote oog), waarbij ze uit de oplossing. Zaaien van primaire alvleesklier acini Incubeer de verteerd acinaire clusters bij 37 ° C in een cel cultuur incubator voor 2 h, zodat voor het herstel van de cel. Tijdens de cel herstel vacht 48-well multi wells met 100 μl van geneutraliseerde rat staart collageen ik en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een cel cultuur incubator toe een hydrogel kussen te vormen. Na 2 h van cel herstel, verzamelen acinaire celsuspensie in een conische buis, spin down gedurende 5 minuten bij 100 x g bij 18 ° C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de acini in de juiste hoeveelheid acinaire kweekmedium (150 μl voor elk putje van de plaat van een 48 goed weefselkweek). Zaad elke gedissocieerde alvleesklier in 16 putten te verkrijgen van een optimale dichtheid (100-120 acinaire clusters per putje). Verdun deze acinaire suspensie met een gelijk volume geneutraliseerde rat staart collageen ik oplossing, houden van buizen op ijs. Meng zorgvuldig en snel het zaad van de celsuspensie bovenop het collageen kussen beschreven in punt 2.2.2 (300 μL voor elk putje van de plaat van een 48 goed multi goed weefselkweek). Incubeer 1 uur bij 37 ° C in een cel cultuur incubator toe een hydrogel te vormen. Inductie van alvleesklier organoids Overlay collageen hydrogels met 500 μL van acinaire kweekmedium aangevuld met 2 μg/ml doxycycline voor YAP-afhankelijke inductie van alvleesklier organoids van R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A muizen; negatieve controles worden geleverd door wt cellen gekweekt in dezelfde voorwaarden of R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A cellen gekweekt in afwezigheid van doxycycline. Cultuur acinaire cellen in acinaire kweekmedium aangevuld met 2 μg/mL doxycycline voor 5 tot 7 dagen vernieuwen kweekmedium (300 μl per putje) elke 48 uur en na organoid formatie van de morfologische veranderingen richting cyste vorming ductaal-achtige structuren ( Figuur 2C). Zodra organoids worden gevormd, cellen kunnen worden gepasseerd in de alvleesklier organoid kweekomstandigheden of geoogst voor verdere analyses (bv: RNA extractie, immunofluorescentie). Sub kweken van alvleesklier organoids Voor de beoordeling van de capaciteit van hun zelf-vernieuwing, passage klonaal YAP-geïnduceerde alvleesklier organoids (yDucts) in drie-dimensionale kelder membraan matrix hydrogels (alvleesklier organoid kweekomstandigheden) onafhankelijk van exogene YAP/TAZ levering (dwz. onafhankelijk van het beheer van de doxycycline). Bereiden van trypsine 0,05%/EDTA; 100% groeifactor verminderde kelder membraan matrix; Alvleesklier Organoid Medium en Collagenase ik oplossing B. Bereiden een conische 15 mL tube met 4 mL Collagenase ik oplossing B voor elk putje te worden gepasseerd. Negeren kweekmedium, zorgvuldig hydrogels uittreksel uit de putten door behoedzame aspiratie en overbrengen naar de conische buisjes. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, met continue krachtig schudden zodat volledige spijsvertering van de collageen-matrix (check elke 10 min totdat de hydrogel is volledig ontbindend) buizen. Spin down herstelde cellen bij 750 x g gedurende 2 min en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Incubeer herstelde cellen in 1 mL trypsine 0,05%/EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Verdun trypsine met 9 mL PBS 1 x draaien van bij 750 x g gedurende 2 min en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Resuspendeer de pellet cel in ijs koud groeifactor verminderde kelder membraan matrix en zaad in ultra-lage bijlage platen (meestal een druppel 150 μl in een put van een 24-well-plate). Laat de kelder membraan matrix hydrogel stollen door het broeden van de platen in een cel cultuur incubator 40 minuten bij 37 ° C en vervolgens bedekken met alvleesklier Organoid Medium (500 μL voor elk putje). yDucts zal groeien als de cyste-achtige organoids in 7-10 dagen (figuur 2D). Voor verdere passaging organoids kan worden verwijderd uit kelder membraan matrix door incubatie in ijs koud PBS 1 x voor 30 min, gevolgd door wassen 3 keer door de spin naar beneden bij 180 x g gedurende 5 min en hersuspensie in ijs koud PBS 1 x om te voorkomen dat de overdracht van de matrix. Organoids worden dan losgekoppeld met trypsine 0.05% voor 10 min te verkrijgen van een schorsing van de afzonderlijke cellen en reseeded in verse kelder membraan matrix en vervolgens bedekt met alvleesklier Organoid Medium (zoals in 2.4.7-2.4.8). yDuct organoids kan worden cryopreserved in vloeibare stikstof door herstellende is van 100% kelder membraan matrix cultuur zoals in stap 2.4.9, trypsinebehandeling, vermijden en opslaan in de alvleesklier Organoid Medium aangevuld met 10% DMSO. yDuct organoids zijn snel bevroren bij-80 ºC en vervolgens in vloeibare stikstof wordt bewaard.