Chromatin looping spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation; Allerdings gab es keine technologische Fortschritte, die eine selektive und reversible Änderung des Chromatins Schleifen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein leistungsfähiges System für Chromatin Schleife Reorganisation Loci gezielt mit CRISPR-dCas9 (CLOuD9) gezeigt, um selektiv und reversibel Genexpression zu modulieren.
Jüngste Studien haben deutlich gezeigt, dass Langstrecken, dreidimensionale Chromatin looping Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression, aber ob die Schleife für verantwortlich ist oder ein Ergebnis von Veränderungen in der Genexpression nach wie vor ist unbekannt. Bis vor kurzem wie Chromatin Schleifen die Regulierung der Genaktivität und zelluläre Funktion beeinflusst wurde relativ unklar und Einschränkungen in vorhandenen Methoden, diese Strukturen zu manipulieren verhindert eingehende Erforschung dieser Interaktionen. Um diese Unsicherheit zu beseitigen, wir entwickelten eine Methode für die selektive und reversible Chromatin Schleife Re-Organisation mit CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Die Dynamik des Systems CLOuD9 wurde durch erfolgreiche Lokalisierung von CLOuD9 Konstrukte genomic Loci um lokale Chromatin Konformation modulieren Ziel nachgewiesen. Wichtig ist, ist die Fähigkeit zum Umkehren des induzierten Kontakts und Wiederherstellen der endogenen Chromatin-Konformation auch bestätigt worden. Modulation der Genexpression mit dieser Methode stellt die Fähigkeit zur zellulären Genexpression regulieren und unterstreicht das große Potenzial für Anwendungen dieser Technologie bei der Schaffung stabiler de Novo Chromatin-Schleifen, die deutlich gen beeinflussen Ausdruck im Kontext von Krebs und Entwicklung.
Die Beziehung zwischen Chromatin Falten in den Zellkern und die spezifische Organisation des Genoms hat großes Interesse in den letzten Jahren sammelte, wie sich gezeigt hat, eng verbunden mit der Gen-Expression-1,–2sein. Während die genaue Beziehung zwischen Genaktivität und Modulation der Chromatinstruktur unklar bleibt, hat wurde vermutet, dass die Wechselwirkungen zwischen chromosomalen Kontakte durch dynamische dreidimensionale Chromatin Organisation dienen ein gen regulatorische Funktion3. In der Tat, solche Wirkung auch auf die menschliche Globin-gen-Locus, nachgewiesen wo der Locus Kontrollregion (LCR) die Aktivität der Globin-Gene Entwicklungsgeschichtlich gezielt reguliert durch die Schaffung einer Chromatin-Schleife zwischen den beiden Regionen4. Jedoch in dieser und anderen Regionen ist es unklar, ob eine Ursache oder Folge von Veränderungen in der Genexpression Chromatin looping ist.
Bis jetzt blieb die Herausforderungen bei der Untersuchung dieses Phänomens. Andere Versuche zur Induktion Chromatin Schleifen beteiligt z. B. Veränderung der linearen DNA-Sequenz oder komplizierte Verfahren erfordern eine Fülle von Hintergrundwissen über bestimmte Elemente, die Schleife5,6zu erleichtern, 7,8. Während bisherige Arbeit hat vorgeschlagen, dass das Chromatin Fahrt gen-Expression in eine spezifische und eingeschränkten Rahmen7,Schleifen ist8, das Niveau an welchem Chromatin looping Transkription Global wirkt sich darüber hinaus ungewiss. Obwohl Interesse an die Auswirkungen der Langstrecken Schleifen auf die Genexpression in den letzten Jahren kontinuierlich gewachsen ist, bestehen unbeantwortete Fragen über den Aufbau und die Beibehaltung von Chromatin Kontakte Genaktivität ändern.
Die Technologie, die wir entwickelt haben beschäftigt die Nuklease mangelhaft gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) – CRISPR – associated Protein 9 (dCas9), um alle genomic Loci9breit anwendbar gezielt zu ermöglichen. Diese Technologie eliminiert die komplexen Fragen im Zusammenhang mit Änderungen der linearen DNA-Sequenz und ist ohne wesentliche Vorkenntnisse bestimmter Schleife Komponenten zu erreichen. Vor allem ist das Tool universal und breit anwendbar auf Chromatin Loops in Entwicklung sowie in einer Vielzahl von Krankheiten, wie Krebs erkannt. Die Macht der CLOuD9 belegen reversibel verändern die Struktur der Schleifen Genexpression effektiv zu modulieren.
The Most wichtige Schritte im CLOuD9 Chromatin Schleifen sind: (1) entwerfen oder mit Hilfe der richtigen gRNAs, 2) wechselnde Medien täglich auf CLOuD9 ausgestrahlt Zellen, einschließlich ABA oder DMSO, 3) Erhaltung der Frische der ABA, und (4) genaue und sorgfältige Beurteilung der Durchführung Chromatin-Konformation.
Die Grenzen der CLOuD9 befinden sich hauptsächlich in der Fähigkeit, Leitfäden für die Zielregion der Wahl zu gestalten. Guide-RNAs führen die wichtige Aufgabe der Lokalisierung der dCas9 Komponenten DNA Zielregionen zu dimerized werden und die Wirksamkeit der Guides basieren auf ihre spezifischen Ziel-Site. Ohne die richtige gRNA Komponenten induziert die CLOuD9 System nicht reversibel bilden können Schleifen. So wird durch mehrere Hilfslinien für die einzelnen Regionen von Interesse Gestaltung und Verbreitung der Führer über einen Bereich von 250-1000 bp, mindestens eine erfolgreiche Führer sichergestellt werden. Leitfaden-Lage ist auch integraler Bestandteil der genaue Ergebnisse. Es ist wichtig zu vermeiden, Führungen befindet sich in Transkription Faktor Bindungsstellen oder anderen kritischen Regionen um Hintergrundeffekte wie oben oder down-Regulation der Transkription zu verhindern. Darüber hinaus kann die genaue Lage des Konstrukts CLOuD9 leicht Transkription des Zielgens auswirken. Dies unterstreicht die Bedeutung des Tests mehrere Paare von Leitfäden für jedes Zielgebiet, das robusteste paar um zu Versuchszwecken zu identifizieren. Darüber hinaus in jedem Paar Zielregionen, das CSA-Konstrukt sollte mit gRNAs für S. Aureusgezielt und das CSP-Konstrukt sollte mit gRNAs für S. Pyogenes für targeting Spezifität ausgerichtet sein.
Um genaue Ergebnisse und korrekte Dimerisierung zu gewährleisten, ist es auch wichtig, die Frische der zellulären Umgebungen nach der Transduktion der CLOuD9 Konstrukte zu erhalten. Tägliche Medienwechsel und die Zugabe von frischen Dimerizer (oder Control) sorgt dafür, dass die komplementäre Konstrukte in der Nähe bleiben und die veränderten Chromatin-Konformation bewahren. Darüber hinaus ist es wichtig, authentische Resultate, garantieren die ABA ist frisch und entsprechend nach den Hersteller-Protokoll (eröffnet innerhalb von 6 Monaten, kalt, lichtgeschützt aufbewahrt) gespeichert wurden.
Insbesondere wurde ABA Dimerizer für CLOuD9 mit ABI und PYL Dimerisierung Proteine verwendet, anstatt mehr allgemein FRB und FKBP-System genutzt. Die Notwendigkeit einer Rapalog für die FRB/FKBP-System würde die Anwendbarkeit der CLOuD9, wegen der Giftigkeit zu Krebszellen beschränkt haben. Das Alternativsystem ABI/PYL umgangen diese Einschränkung, effektiv ermöglicht CLOuD9 breiter nutzbar sein.
Gemeinsam entwickelten wir CLOuD9, eine einzigartige und robuste Technologie, die gewaltsam können aber reversibel schaffen Kontakte zwischen langfristigen Ziel genomic Loci. Durch Induktion Chromatin Schleifen, zeigen wir auch, dass CLOuD9 genutzt werden können, um gen-Expression in den entsprechenden zellulären Kontext ändern. Die Anpassungsfähigkeit der Technologie ermöglicht die uneingeschränkte Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen jeden zwei genomic Loci, ohne Vorkenntnisse in der Schleife Regionen oder looping Mechanismen. CLOuD9 einzigartige nachgewiesene Reversibilität ermöglicht darüber hinaus weitere Untersuchung der Schleifen Mechanismen in Krankheit und Entwicklung. Während die zielgenaue Auswirkungen von Chromatin looping eindeutig nachgewiesen wurden, ist noch Daten bietet Einblick in die Auswirkungen der Ziel-looping und die weiteren Auswirkungen auf die Schlaufen am Ziel zu sein.
Unsere Daten nur wenige Anwendungen dieses Tool zeigt aber impliziert die große zugrunde liegende Idee, dass Chromatin Anordnung der Genexpression bezeichnend ist. Unsere Technologie kann verwendet werden, um zu studieren und die Nuancen der Chromatinstruktur in Genregulation und verbessert das allgemeine Verständnis der Rolle des Chromatins Falten in der Transkription von Genen zu offenbaren. Ein besseres Verständnis für die Feinheiten der transkriptionellen Dynamik kann eine Vorreiterrolle in der Forschung und Behandlung von Krebs, Erbkrankheiten und angeborene Erkrankungen, in denen verschiedene, die Chromatin Assembly zweifellos Gen Ausdruck20verändert, 21,22,23. Folgearbeiten CLOuD9 Technologie beleuchten weitere Details über die Anordnung und die Dynamik von Chromatin Domains und wie sie fahren Falten zu stabilen Genexpression in Entwicklung und Krankheit aufrecht zu erhalten.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, s. Batista, E. Calo und die gesamte Wang-Labor für technische Unterstützung und kritische Lektüre des Manuskripts. S.L.M. wurde in dieser Arbeit durch die NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) und das National Cancer Institute (1F99CA222541-01) unterstützt. K.C.W. wird durch den Career Award für Mediziner aus dem Burroughs Wellcome Fonds unterstützt und ist ein Donald E. und Delia B. Baxter Foundation Faculty Scholar.
RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
Buffers | |||
Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |