Bedömningen av lysosomala alkalisering i tarmen av Live Caenorhabditis elegans
Summary
En steg för steg guide till probe förlust av lysosomala surhet i inälvan av C. elegans med det pH-känsliga vitala färgämnet 5 (6) – karboxi – 2′, 7′-dichlorofluorescein diacetat (cDCFDA)
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en modell som ofta används för att studera livslängd och utvecklingsmässiga vägar. Sådana studier underlättas av insyn i djuret, förmågan att framåt och bakåt genetiska analyser, den relativa lätthet av generera fluorescently märkta proteiner och användningen av fluorescerande färger som antingen kan vara microinjected i början embryot eller införlivad med sin mat (E. coli stam OP50) att märka cellulära organeller (t.ex. 9-dietylamino-5 H-bens (a) phenoxazine-5-en och (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} – N – [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Här presenterar vi en fluorescerande pH-känsliga färgämnet som fläckar intestinal lysosomer, som ger en visuell avläsning av dynamiska, fysiologiska förändringar i lysosomala surhetsgraden i levande maskar. Detta protokoll mäter inte lysosomal pH, men snarare syftar till att fastställa en tillförlitlig metod för att bedöma fysiologisk relevanta varianter i lysosomala surhetsgrad. cDCFDA är en cell-diffusionskoefficient förening som konverteras till fluorescerande fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) vid hydrolys av intracellulära esteraser. Protonation inuti lysosomerna fällor cDCF i dessa organeller, där det ackumuleras. På grund av dess låga pKa av 4.8, har denna färg använts som en pH-sensor i jäst. Här beskriver vi användningen av cDCFDA som ett kosttillskott att bedöma surheten i intestinal lysosomer i C. elegans. Denna teknik möjliggör detektering av alkalinizing lysosomer i levande djur, och har ett brett sortiment av experimentella tillämpningar inklusive studier på åldrande, autofagi och lysosomala biogenes.
Introduction
Utseendet på protein aggregat är allmänt accepterat för att vara ett signum för åldrande i eukaryota celler1,2,3, och bildandet av som tros vara bland princip förare av cellulära åldras4 , 5 , 6 , 7. det finns växande bevis för att som cellerna ålder, proteinkatabolism är nedsatt, vilket leder till en ökning av protein aggregering. Kollapsen av proteolys i åldrande celler innebär en försämring av autofagi8 samt proteasom-medierad protein nedbrytning9. Slutligen, irreversibla protein oxidation ökar i gamla celler, ytterligare försämrar protein katabolism10.
Autofagi var ursprungligen tänkt att vara en icke-selektiv process för bulk nedbrytningen av skadade proteiner, men senare studier har visat att autofagi är mycket selektiv att katabolismen av protein aggregat och dysfunktionella organeller som inte mottaglig för nedbrytning via andra protein clearance mekanismer11. Under processen av autofagi är skadade och aggregerade proteiner binds i en dubbel-membran vesikler kallas autophagosome. Denna autophagosome sedan säkringar med sura organeller kallas lysosomer, vilket leder till nedbrytning av autophagosome Last12. Lysosomer representerar slutpunkten av den autophagic vägen och delta i olika cellulära processer såsom membran reparation, transkriptionell kontroll och näringsämnen avkänning; belysa deras central roll i cellernas homeostas (ses i ref. 13). Flera studier har visat en association mellan en åldersberoende minskning av lysosomala funktion och olika neurodegenerativa sjukdomar13. Konsekvent, kan återställa lysosomal funktion i äldre celler fördröja uppkomsten av åldersrelaterade fenotyper14,15. Studier av sammansättningen av den intralumen miljön tyder på att kollapsen av lysosomala funktion i äldre celler inte är på grund av en minskning i produktionen av lysosomala proteaser16. Alternativt har det föreslagits att förlust av intralysosomal syra, ett avgörande krav på dess enzymatiska aktivitet, kan ligga bakom nedgången i lysosomen-medierad proteolys17. För att kunna utforska denna hypotes, är det nödvändigt att utveckla reagenser och protokoll sond dynamiska förändringar i lysosomal pH i levande celler i ett reproducerbart och konsekvent sätt.
Inälvan av C. elegans är de större metabola vävnaden i worms och det är en viktig regulator av systemisk homeostas och livslängd. Vi har utvecklat analyser för att utvärdera förändringar i surhetsgraden i lumen av intestinal lysosomer av maskar att avgöra hur Lysosomen-medierad proteolys bidrar till åldrandet. Ännu om pH-känsliga fluorophores har använts tidigare i C. elegans för att markera intestinal lysosomer, har inte varit ett försök att upprätta en framgångsrik protokoll som kan upptäcka små ökningar i lysosomal pH i vivo18. Här, tillhandahåller vi ett protokoll som kan användas för att upptäcka förlust av lysosomala surhet i C. elegans intestinala celler med ett enkelt och bekvämt utfodring protokoll som innehåller en pH-känsliga fluorophore (cDCFDA) i OP50 mat.
Protocol
Representative Results
Discussion
En mängd olika cellulära och molekylära händelser bidra till åldrande, livshistoria drag och genetiska faktorer. Vår senaste studie22 antyder att den reproduktiva cykeln spelar en viktig roll i att kontrollera av soma genom reglering av lysosomala pH dynamics lämplighet. Vi visade att lysosomala-medierad proteolys främjas medan djur aktivt återskapa genom uppreglering av v-ATPas transkription, som i sin tur garanterar sura lysosomer. Vid slutet av reproduktion, v-ATPas uttryck droppar, ly…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Caenorhabditis genetik centrum för stammar, naturvetenskap och teknik forskning rådet (NSERC), och Kanada Stiftelsen för Innovation (CFI) för finansiering. Vi vill tacka Dr Lizhen Chen (Institutionen för Cell Systems och anatomi, UT hälsa San Antonio) för att tillåta obegränsad användning av hennes lab faciliteter för alla C. elegans experiment samt Dr Exing Wang (Associate Director, optisk Imaging anläggning UT hälsa San Antonio) för hjälp med konfokalmikroskopi. Vi vill också tacka Dr Myron Ignatius för att ge stöd och uppmuntran att underlätta video shoot.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
Referências
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson’s disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?. Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington’s disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age?. Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genética. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
