JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Microarray Assay протеина для серологических определения антиген специфические антитела ответы следующие Clostridium difficile инфекции

Published: June 15, 2018
doi:
10.3791/57399
, ,
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen’s Medical Centre,University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine,Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen’s Medical Centre,University of Nottingham

Summary

Эта статья описывает метод простой протеина microarray для профилирования гуморального иммунного ответа группе 7-plex высоко очищенный Clostridium difficile антигенов в человеческой сыворотки. Протокол может быть продлено определение специфического антитела ответов в подготовке поликлональных внутривенного иммуноглобулина.

Abstract

Мы предоставляем подробный обзор assay microarray романный протеин высокой пропускной способностью для определения анти –Clostridium difficile уровни антител в человеческой сыворотки и отдельных препаратов поликлональных внутривенного иммуноглобулина (IVIg). Протокол описывает методологические этапы подготовки проб, печать массивов, процедуры анализа и анализа данных. Кроме того этот протокол может быть дальнейшее развитие для включения различных клинических образцов, включая плазмы и клеточной supernatants культуры. Мы покажем, как microarray протеина может использоваться для определения сочетания изотипа (IgG, IgA, IgM), подкласс (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), и штамм специфических антител к высоко очищенный целый C. difficile токсинов A и B (toxinotype 0, штамм ВПИ 10463, ribotype-087), токсин B от C. difficile токсин B-только выражая штамм (CCUG 20309), предшественник формы фрагмента B бинарный токсин, pCDTb, ribotype специфических всей поверхности слой белков (SLPs; 001, 002, 027) и контролировать белков (столбняка Анатоксин и Candida albicans). В ходе эксперимента, microarrays проверяются с сывороток от физических лиц с C. difficile инфекции (CDI), лица с кистозный фиброз (CF) без диареи, здоровые элементы (HC) и от частных лиц до и пост IVIg терапии для лечение CDI, комбинированного иммунодефицита расстройства и хронических воспалительных демиелинизирующих polyradiculopathy. Мы сталкиваемся с существенные различия между группами пациентов, коммерческие препараты IVIg, и сера до и следующие внутривенное узкоспециализированного нейтрализации токсинов и multi изотип специфическое антитело уровней. Кроме того существует существенная корреляция между microarray и энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для уровней IgG антитоксин в образцах сыворотки. Эти результаты показывают, что microarray может стать перспективным средством для профилирования антитела ответы на антигены C.difficile прививку или инфицированных людей. С дальнейшего уточнения антигена панелей и снижением издержек производства мы ожидаем, что технология microarray дна может помочь оптимизировать и выберите наиболее клинически полезным immunotherapies C. difficile инфицирования пациента конкретным образом.

Introduction

Этот протокол описывает разработки и проверки assay microarray Роман и индивидуальных белков для обнаружения и полу количественной оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретных ответов на антигены C. difficile . Мы успешно используем наши C. difficile-assay microarray конкретные как перспективный новый инструмент для композиционных bioanalysis специфическое антитело содержание пациента сыворотки1,2, подготовка IVIg3, и выявление особенностей антитела, которые коррелируют с неблагоприятные исходы в CDI4. Мы демонстрируем, как образцы сыворотки biobanked и коммерческие препараты IVIg могут быть проанализированы на microarray слайды, позволяя высокое качество воспроизводимых профилирование C. difficile возбудителя специфические антитела ответов в этот assay.

Многие здоровые дети и взрослые имеют обнаружить сыворотке антител IgG и IgA C. difficile токсинов A и B5,6. Считается, что они возникают после временной экспозиции во время младенчества и после воздействия C. difficile в зрелом возрасте. По этой причине был поликлональных IVIg используется для лечения как периодических, так и молниеносный CDI7,8,9-лейбл. Однако его окончательного роль и режим действий остается неясным. Несколько исследований показали, что гуморального иммунного ответа на C. difficile токсинов играет роль в болезни презентации и результат. В частности бессимптомных больных показывают увеличение сыворотка анти-токсин IgG концентрации по сравнению с пациентами, которые разрабатывают симптоматической болезни10. Очевидном Ассоциация сообщила средний анти-токсин IgG титры и смертности от всех причин 30-день11. Несколько докладов также показали связь с защитой от повторения и антитела ответы на токсин A, B и несколько не токсин антигены (Cwp66, Cwp84, Флик, FliD и поверхностный слой белки (SLPs))12,13 , 14 , 15. Эти соображения стимулировали развитие первая пассивная иммунотерапия наркотиков таргетинга C. difficile токсин B (bezlotuxumab), который недавно был одобрен в США продуктов питания и медикаментов и европейские лекарства Агентство по предотвращению периодических CDI16. Стратегии вакцинации с использованием рекомбинантного токсин фрагменты или инактивированные токсины, также в настоящее время в развитие17,18,19. Эти новые терапевтические подходы, несомненно, будет стимулировать требование для оценки гуморального иммунного ответа на нескольких антигенов в больших выборок.

Сегодня существует заметное отсутствие коммерчески доступных высок объём анализов способны одновременно оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретные ответы на антигены C. difficile . Есть неудовлетворенные потребности в разработке таких анализов для облегчения будущих исследований и клинического применения. Microarrays протеина являются метод для иммобилизации большое количество индивидуально очищенные белки как пространственно организованный массив пятен на микроскопические поверхность на основе слайдов с помощью робототехнической системы, которая может быть либо контакта20 или не контакт Печать инструмент21. Пятна могут представлять собой сложные смеси, например lysates клетки, антитела, гомогенатах ткани, эндогенного или рекомбинантных белков пептиды, выделениями или наркотиков22,23.

Технология microarray протеина имеет явные преимущества над стандартной внутренней ELISA методы, которые традиционно использовались для оценки анти –C. difficile антитела ответов. К ним относятся расширение возможностей для обнаружения широкий спектр мульти изотип специфических антител против более обширная группа белковых мишеней, сокращение объема требований для антигенов, проб и реагентов и расширение возможностей для включения большего количество технических реплицирует, помимо нескольких внутреннего контроля качества (QC) меры1. Microarrays поэтому более чувствительным, точные и воспроизводимые и имеют больший динамический диапазон. Эти факторы делают microarrays дешевле и потенциально выгодные альтернативы ELISAs для крупномасштабных обнаружения известных белков. Однако недостатки технологии microarray главным образом результатом большой авансовые расходы, связанные с созданием группы высокоочищенных антигенов и создание технологической платформы.

Microarrays протеина широко использовались в последние два десятилетия как средство диагностики и базовые исследования в клинических приложений. Приложения включают в себя выражения протеина профилирования, исследование ферментов субстрат отношения, скрининг биомаркеров, анализ хост микробных взаимодействий и профилирование антитела специфика23,24, 25,26,27,28. Созданы многие новые microarrays белка/антиген возбудителя, в том числе малярией (Plasmodium)29, ВИЧ-130, гриппа31, тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)32, вирусные геморрагические лихорадки33 , Герпесвирусы34и35туберкулеза.

Настоящий Протокол относится к созданию легко операционных C. difficile реактивной антигена assay microarray, которая позволяет точной, точной и конкретной количественной оценки multi изотип и штамм специфические антитела ответы на C. несговорчивый антигенов в сыворотки и поликлональными IVIg. Здесь мы включить представителя результаты, относящиеся к приемлемым microarray пробирного производительность по сравнению с ELISA, а также анализа точности и воспроизводимости профили. Этот assay может быть дальнейшее развитие для профилирования других клинических образцов и устанавливает новый стандарт для исследований в молекулярные основы CDI.

Protocol

1. Подготовка Microarray пластины Разбавить C. difficile антигены с буфером печати [PBS-анимации Трегалоза (50 мм)] в оптимальной концентрации, (который был предварительно перед запуском пациента sera): токсин (200 мкг/мл) и токсинном B (100 мкг/мл), pCDTb (200 мкг/мл) и очищенная родной весь SLPs, производн?…

Representative Results

Рисунок 1 иллюстрирует блок-схемы, описывающие основные шаги в протоколе описаны. Рисунок 2 показывает тестов корреляции Спирмена, демонстрируя значительное соглашение между microarray и ELISA IgG и IgA анти-токсин A и B уровней в сыворотке пациент…

Discussion

В этом протоколе мы показали, что microarray является подходящей платформой для определения гуморального иммунного ответа до C. difficile белков антигенов в пациента сыворотки (рисунки 3 и 6) и коммерческие препараты IVIg (рис. 5). Мы также продемонстрировали, ч?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Гермес стипендий Негм Ola и Таня Монаган и через отдельное финансирование от центра Ноттингема пищеварительной заболеваний и NIHR Ноттингем пищеварительной заболеваний биомедицинских научно-исследовательского центра.

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer Digilab, Malborough, MA, USA N/A Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710. Innopsys N/A A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0 Innopsys N/A Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin Parallel Synthesis Technologies SMT-P75 Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator Thermo Scientific 41102426 To store the new and printed slides.
384-well plate Genetix X7022UN To prepare the antigens.
Plate cover Sigma Aldrich, UK CLS6570-100EA To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides Schott,  Germany 1064875 The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders GraceBio Labs, USA 204862 Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . 
Candida albicans lysate NIBSC PR-BA117-S Positive control
Tetanus Toxoid  Athens Research and Technology 04/150 Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707 Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. 
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-1 Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. 
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-2 Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. 
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-3 Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. 
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-4 Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. 
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701 Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701-1M Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701-2M Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090713 Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific Vector Labs BA-3080 Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT Southern Biotec 9052-08  Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT Southern Biotec 9060-08   Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT Southern Biotec 9210-08    Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT Southern Biotec 9190-08   Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated Vector Labs BA-3030 Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT Southern Biotec 9130-08 Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT Southern Biotec 9140-08   Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT Southern Biotec 9020-08  Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter Thermo scientific 723-2520 Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich, UK A7284 Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent Dako, UK S3022 To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5 eBioscience SA1011 Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) Toxins Group, Public Health England NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) Toxins Group, Public Health England NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb University of Bath  NA Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins Dublin City University  NA
Vigam (IVIg preparation 1) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
Privigen (IVIg preparation 2) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
Intratect (IVIg preparation 3) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
  2. Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
  3. Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
  4. Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, 31 (2017).
  5. Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
  6. Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
  7. Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
  8. Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
  9. Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
  10. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
  11. Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, 1453-1460 (2013).
  12. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
  13. Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
  14. Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
  15. Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
  16. Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
  17. Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
  18. Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
  19. Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), (2017).
  20. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  21. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
  22. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , 21 (2013).
  23. Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
  24. Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
  25. Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
  26. Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
  27. Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
  28. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
  29. Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
  30. Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
  31. Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
  32. Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
  33. Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
  34. Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
  35. Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
  36. Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
  37. Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
  38. Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
  39. Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  40. Guo, A., Zhu, X. -. Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , (2007).

Tags

Protein MicroarrayClostridium DifficileAntibody ResponseAntigenImmunotherapyMulti-isotypeStrain-specificAntigen DilutionMicroarray PrintingSlide PreparationArrayer SetupData Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Negm, O. H., Hamed, M., Monaghan, T. M. A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection. J. Vis. Exp. (136), e57399, doi:10.3791/57399 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image