Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência
Summary
O presente protocolo descreve as etapas para obter a trombose venosa, usando um modelo de estase. Além disso, estamos usando um método não-invasivo para medir a formação de trombos e resolução ao longo do tempo.
Abstract
Trombose venosa profunda é uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 500. Trombose venosa profunda pode levar à morte por embolia pulmonar ou resultados na síndrome pós-trombótica, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração, ou em hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativa crônica respiratória compromisso. Esta é a mais comum doença cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral isquêmico e é um desafio clínico para todas as disciplinas médicas, como isso pode complicar o curso de outras doenças como o câncer, doença sistêmica, cirurgia e grande trauma.
Modelos experimentais são necessários para estudar esses mecanismos. O modelo de estase induz o tamanho do trombo consistente e uma quantidade quantificável de trombo. No entanto, é necessário sistematicamente ligate ramos laterais da veia cava inferior para evitar a variabilidade em tamanhos de trombo e qualquer interpretação de dados errôneos. Nós desenvolvemos uma técnica não-invasiva para medir o tamanho do trombo usando a ultra-sonografia. Usando esta técnica, que podemos avaliar o desenvolvimento do trombo e resolução ao longo do tempo, no mesmo animal. Essa abordagem limita o número de ratos necessários para quantificação da trombose venosa consistente com o princípio da substituição, redução e refinamento de animais na investigação. Nós demonstramos que o peso do trombo e análise histológica de trombo tamanho se correlacionam com medição obtidos com ultra-sonografia. Portanto, o presente estudo descreve como induzir trombose venosa profunda em camundongos, usando o modelo de estase de veia cava inferior e como monitorá-lo usando o ultra-som de alta frequência.
Introduction
Tromboembolismo venoso (TEV), que é composto de trombose venosa profunda (TVP) e embolia pulmonar, é a terceira causa principal de morte cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. É uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 5001. VTE pode levar a: 1) morte por embolia pulmonar; 2) pós-trombótica síndrome, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração; ou 3) hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativo compromisso respiratório crônico. TeV é uma doença multi fatorial e pode resultar de estase do fluxo de sangue, danos nas paredes dos vasos, e/ou Estados de hipercoagulabilidade, devido a uma perturbação do equilíbrio entre a coagulação e os sistemas fibrinolíticos, como tem sido descrito há mais de uma centena de anos por Virchow e é conhecido como Tríade de Virchow.
Porque na maioria dos casos, é impossível obter amostras humanas de TVP, pesquisadores desenvolveram modelos animais experimentais de TVP. Vários animais, incluindo rato2rato3, coelho4, porco5, cão6e primatas não humanos7 têm sido utilizados. Os ratos podem ser geneticamente modificados e são os animais mais frequentemente usados para estudar a TVP. No entanto, como em todos os animais, DVT espontâneo não é observado em ratos. Assim, alterações físicas ou químicas da parede da veia são usadas para criar a trombose em ratos. Anteriormente nós usamos o modelo de cloreto férrico para induzir trombose na veia cava inferior (VCI) de ratos8,9,10. Este modelo tem a vantagem de produzir confiantemente trombos oclusivos em poucos minutos e pode ser usado para investigar o papel das drogas anticoagulantes e plaquetária durante TVP aguda. No entanto, é um procedimento de terminal. Assim, para estudar TVP aguda e crônica, o modelo de estase é mais adequado. Neste modelo, formação de trombos é induzida pela interrupção completa do fluxo de sangue na veia cava inferior, um dos fatores na tríade de Virchow para desenvolvimento de TVP. Este modelo pode ser usado para estudar a formação de TVP e resolução, que é uma vantagem em comparação com o FeCl3 modelo11.
Nós desenvolvemos um método não-invasivo para acompanhar a formação de trombos e resolução ao longo do tempo usando um sistema de ultra-som de alta frequência de micro imagem12. Demonstramos anteriormente que medição da trombose venosa por ultra-som correlaciona-se favoravelmente com trombos obtidos patologicamente. Confirmamos em dois estudos subsequentes que medições obtidas com ultra-som se correlacionam com o peso do trombo e área de trombo quantificada por histoquímica9,10. Mais importante, nós mostraram que o ultra-som de alta frequência pode ser usado para monitorar a formação de trombose venosa profunda em ratos12. Ele também pode ser usado para quantificar a resolução do trombo em uma forma não-invasiva.
Aqui, descrevemos o protocolo que permite a formação de trombos, usando o modelo do rato de trombose induzida em estase e como formação de trombos pode ser monitorizada de forma não-invasiva ao longo do tempo usando o ultra-som de alta frequência.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem várias etapas críticas para a formação de trombo venoso bem sucedida usando o modelo de estase. Indução da trombose venosa profunda é mais desafiador em ratos velhos, devido ao acúmulo de gordura em torno da veia cava inferior e a aorta. Idealmente, os ratos submetidos a este procedimento devem ser de 8 – 10 semanas de idade. Deve ter grande cuidado para não induzir dano endotelial na veia cava inferior durante a dissecção romba e ligadura. Além disso, é crucial para manter o animal em uma incubadora…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um subsídio do coração e derrame Foundation do Canadá e o Morris e Bella Fainman Family Foundation. Os autores gostaria de agradecer sua ajuda técnica com o sistema de imagens de ultra-som VEVO770 Veronique Michaud.
Materials
| 6-0 perma-hand silk suture | Ethicon | 706G | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| blunt forceps (straight and curved) | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Moria Spring Scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| 1ml syringes | BD Biosciences | ||
| 26G needles | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 High Resolution Imaging System | Visualsonics | No longer sold | |
| SR Buprenorphine | ZooPharm | Given to LDI by Vet | |
| Surgery Microscope | Leica | Leica M651 | |
| Systan eye oinment | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2×2 sterile Gauze | CDMV | #104148 | |
| Cotton Tip Applicators | from JGH | ||
| Transpore hypoallergenic surgical tape | CDMV | #7411 | |
| Ultrasound gel (Aquasonic-100) | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| Incubator | From JGH | ||
| Isoflurane | Dispomed | ||
| Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment | Dispomed | ||
| Hair remover | Nair | ||
| Water heated hard pad | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Gaymar heater water pump TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| Infra-red heating lamp | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| Mouse rectal temperature prope | emkaTECHNOLOGIES | ||
| Sterile water | From JGH |
Referências
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