Diep-veneuze trombose geïnduceerd door Stasis in muizen gecontroleerd door hoge frequentie Ultrasonografie
Summary
Dit protocol beschrijft de stappen voor het verkrijgen van veneuze trombose met behulp van een stase-model. Daarnaast zijn we met behulp van een niet-invasieve methode voor het meten van de vorming van trombose en resolutie na verloop van tijd.
Abstract
Veneuze trombose is een veel voorkomende aandoening treft 1-2 procent van de bevolking, met een jaarlijkse incidentie van 1 in 500. Veneuze trombose kan leiden tot de dood door middel van longembolie of resultaten in het post-trombotische syndroom, gekenmerkt door chronische beenpijn, zwelling en ulceratie, of in chronische pulmonale hypertensie resulteert in aanzienlijke chronische respiratoire compromis. Dit is de meest voorkomende hart-en vaatziekten na myocardinfarct en ischemische beroerte en een klinische uitdaging voor alle medische disciplines, zoals het het verloop van andere aandoeningen zoals kanker, systemische ziekten, chirurgie en belangrijk trauma kan bemoeilijken.
Experimentele modellen zijn nodig om deze mechanismen te bestuderen. De stase model induceert consistente trombose grootte en een meetbare hoeveelheid trombose. Het is echter moet systematisch afbinden kant takken van de vena cava inferior variabiliteit in maten van de trombose en eventuele foutieve interpretatie te voorkomen. Wij hebben een niet-invasieve techniek voor het meten van trombose grootte met behulp van Ultrasonografie ontwikkeld. Met behulp van deze techniek kunnen we trombose ontwikkeling en resolutie beoordelen na verloop van tijd in hetzelfde dier. Deze benadering beperkt het aantal muizen die nodig zijn voor de kwantificering van veneuze trombose overeenstemming met het beginsel van vervanging, vermindering en verfijning van dieren in het onderzoek. We hebben aangetoond dat trombose gewicht en histologische analyse van trombose grootte correlaat met meting met Ultrasonografie verkregen. Daarom beschrijft de huidige studie hoe voor het opwekken van diep-veneuze trombose in muizen met behulp van de vena cava inferior stase model en hoe om te controleren met behulp van hoge frequentie echografie.
Introduction
Veneuze thromboembolism (VTE), die uit diepe veneuze trombose (DVT) en longembolie bestaat, is de derde belangrijkste oorzaak van cardiovasculaire dood na een hartinfarct en beroerte. Het is een veel voorkomende aandoening treft 1-2 procent van de bevolking, met een jaarlijkse incidentie van 1 in 5001. VTE kan leiden tot: 1) dood door longembolie; 2) post-trombotische syndroom, gekenmerkt door chronische beenpijn, zwelling en ulceratie; of 3) chronische pulmonale hypertensie resulteert in aanzienlijke chronische respiratoire compromis. VTE is een multi factoriële ziekte en kan voortvloeien uit stase van de bloedstroom, schade aan wanden en/of hypercoagulable Staten als gevolg van een verstoring van het evenwicht tussen de stolling en de fibrinolytic systemen, zoals het is meer dan honderd jaar geleden beschreven door Virchow en staat bekend als de Virchow van triade.
Omdat in de meeste gevallen het onmogelijk is om menselijke DVT monsters krijgen, hebben de onderzoekers experimentele dierlijke modellen van DVT ontwikkeld. Verschillende dieren waaronder rat2, muis3, konijn4, varken5, hond6pt7 van de niet-menselijke primaten hebben ingezet. Muizen genetisch kunnen worden gewijzigd en zijn de meest gebruikte dier te bestuderen van DVT. Echter zoals alle dieren, wordt spontane DVT niet waargenomen bij muizen. Dus, fysische of chemische veranderingen van de wand van de ader worden gebruikt voor het maken van trombose bij muizen. Eerder hebben we de ferrichloride model gebruikt voor het opwekken van trombose in de vena cava inferior (IVC) van muizen8,9,10. Dit model heeft het voordeel dat het betrouwbaar produceren occlusieve stolseltjes binnen minuten en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van anti-coagulans en anti-bloedplaatjes geneesmiddelen tijdens acute DVT. Het is echter een terminal procedure. Dus, om te bestuderen van acute en chronische DVT, de stase-model is meer geschikt. In dit model wordt trombus vorming geïnduceerd door de volledige onderbreking van de bloedstroom in het IVC, een van de factoren in de Virchow triade voor DVT ontwikkeling. Dit model kan worden gebruikt om te studeren van DVT vorming en resolutie, wat een voordeel ten opzichte van de FeCl3 model11.
Wij hebben een niet-invasieve methode te volgen van vorming van trombose en resolutie na verloop van tijd met behulp van een micro-imaging hoge-frequentie echografie systeem12ontwikkeld. Wij hebben eerder aangetoond dat meting van veneuze trombose door echografie gunstig met stolseltjes verkregen pathologisch correleert. Wij hebben in twee latere studies bevestigd dat metingen met echografie correlaat met trombose gewicht en trombose gebied gekwantificeerd door histochemie9,10 verkregen. Nog belangrijker, hebben we aangetoond dat hoge frequentie echografie kan worden gebruikt voor het controleren van de vorming van diepe veneuze trombose in muizen12. Het kan ook worden gebruikt om het kwantificeren van trombose resolutie in een niet-invasieve manier.
Hier beschrijven we het protocol waardoor trombose vorming met behulp van de muismodel stase-geïnduceerde trombose en hoe trombose vorming niet-gebeurt na verloop van tijd met behulp van hoge frequentie echografie kan worden gecontroleerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen voor succesvol veneuze trombose vorming met behulp van het stasis-model. Inductie van veneuze trombose is moeilijker in oude muizen als gevolg van de ophoping van vet rond de vena cava inferior en de aorta. Idealiter moet de muizen ondergaan deze procedure 8 – 10-weken oude. Grote zorg moet worden genomen niet ertoe endothelial schade in het IVC tijdens de botte dissectie en ligatuur. Daarnaast is het essentieel om te houden van het dier in een incubator 34 ° C gedurende ten minst…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het hart en de Stichting van de lijn in Canada en de Morris en Bella Fainman Family Foundation. De auteurs bedank Veronique Michaud voor haar technische hulp bij de VEVO770 echografie imaging systeem.
Materials
| 6-0 perma-hand silk suture | Ethicon | 706G | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| blunt forceps (straight and curved) | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Moria Spring Scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| 1ml syringes | BD Biosciences | ||
| 26G needles | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 High Resolution Imaging System | Visualsonics | No longer sold | |
| SR Buprenorphine | ZooPharm | Given to LDI by Vet | |
| Surgery Microscope | Leica | Leica M651 | |
| Systan eye oinment | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2×2 sterile Gauze | CDMV | #104148 | |
| Cotton Tip Applicators | from JGH | ||
| Transpore hypoallergenic surgical tape | CDMV | #7411 | |
| Ultrasound gel (Aquasonic-100) | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| Incubator | From JGH | ||
| Isoflurane | Dispomed | ||
| Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment | Dispomed | ||
| Hair remover | Nair | ||
| Water heated hard pad | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Gaymar heater water pump TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| Infra-red heating lamp | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| Mouse rectal temperature prope | emkaTECHNOLOGIES | ||
| Sterile water | From JGH |
Referências
- Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).
- McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi. Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).
- Singh, I., et al. Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells. Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).
- Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).
- Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom. J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).
- Wakefield, T. W., et al. Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy. J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).
- Robins, R. S., et al. Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice. Blood. 121 (4), 692-699 (2013).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis. Blood. 127 (6), 769-777 (2016).
- Laurance, S., et al. Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. In vivo monitoring of venous thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Luther, N., et al. Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution. Circ Res. , (2016).
- Subramaniam, S., et al. Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development. Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).
- Diaz, J. A., et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).
