Trombosis venosa profunda inducida por estasis en los ratones controlados por sonografía de alta frecuencia
Summary
El presente Protocolo describe los pasos para obtener mediante un modelo de estancamiento de la trombosis venosa. Además, estamos utilizando un método no invasivo para medir la formación de trombos y resolución con el tiempo.
Abstract
La trombosis venosa es una condición común que afecta a 1-2% de la población, con una incidencia anual de 1 en 500. La trombosis venosa puede conducir a la muerte por embolia pulmonar o resultados en el síndrome post-trombótico, caracterizada por la ulceración, inflamación y dolor crónico de la pierna, o en la hipertensión pulmonar crónica dando por resultado significativa crónica respiratoria compromiso. Esto es la enfermedad cardiovascular más común después de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular isquémico y es un desafío clínico para todas las disciplinas médicas, como puede complicar el curso de otros trastornos como cáncer, enfermedad sistémica, cirugía y trauma mayor.
Modelos experimentales son necesarios para el estudio de estos mecanismos. El modelo de estasis induce tamaño del trombo consistente y una cantidad cuantificable de trombo. Sin embargo, es necesario ligar sistemáticamente ramas laterales de la vena cava inferior para evitar la variabilidad en el tamaño del trombo y cualquier interpretación de datos erróneos. Hemos desarrollado una técnica no invasiva para medir el tamaño del trombo utilizando ecografía. Usando esta técnica, podemos evaluar desarrollo de trombos y resolución con el tiempo en el mismo animal. Este enfoque limita el número de ratones que se requiere para la cuantificación de la trombosis venosa consistente con el principio de sustitución, reducción y refinamiento de los animales en la investigación. Hemos demostrado que peso del trombo y el análisis histológico de trombo tamaño correlativo con la medida obtienen con la ecografía. Por lo tanto, el estudio actual describe cómo inducir trombosis venosa profunda en ratones utilizando el modelo de estasis de la vena cava inferior y seguimiento con ultrasonido de alta frecuencia.
Introduction
Tromboembolismo venoso (TEV), que se compone de trombosis venosa profunda (TVP) y embolia pulmonar, es la tercera causa de muerte cardiovascular después de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Es una condición común que afecta a 1-2% de la población, con una incidencia anual de1de 1 en 500. VTE puede conducir a: 1) la muerte por embolia pulmonar; 2) postrombótico síndrome, caracterizado por dolor crónico, inflamación y ulceración; o 3) hipertensión pulmonar crónica dando por resultado significativo compromiso respiratorio crónico. TEV es una enfermedad multifactorial y puede resultar de estasis sanguíneo, daño a las paredes del vaso, o los Estados hypercoagulable debido a una interrupción del equilibrio entre la coagulación y los sistemas fibrinolíticos, como se ha descrito hace más de cien años por Virchow y se conoce como tríada de Virchow.
Porque en la mayoría de los casos es imposible obtener muestras humanas de la trombosis venosa profunda, los investigadores han desarrollado modelos animales experimentales de trombosis venosa profunda. Se han utilizado varios animales incluyendo rata2, ratón3, conejo4, cerdo5, perro6y7 de primates no humanos. Ratones genéticamente modificables y son los animales más utilizados para el estudio de trombosis venosa profunda. Sin embargo, como en todos los animales, no se observó TVP espontánea en ratones. Por lo tanto, alteraciones físicas o químicas de la pared de la vena se utilizan para crear trombosis en ratones. Previamente hemos utilizado el modelo de cloruro férrico para inducir trombosis en la vena cava inferior (IVC) de ratones8,9,10. Este modelo tiene la ventaja de producir confiablemente trombos oclusivos en minutos y se puede utilizar para investigar el papel de los medicamentos anticoagulantes y antiplaquetarios en TVP aguda. Sin embargo, es un procedimiento terminal. Así, para estudiar la TVP aguda y crónica, es más conveniente el modelo de estasis. En este modelo, la formación del trombo es inducida por la interrupción completa del flujo sanguíneo en la vena cava inferior, uno de los factores de la tríada de Virchow para el desarrollo de trombosis venosa profunda. Este modelo puede utilizarse para estudiar la formación de trombosis venosa profunda y resolución, la cual es una ventaja en comparación con las FECLAS3 modelo11.
Hemos desarrollado un método no invasivo para seguir la formación de trombos y la resolución en el tiempo con un sistema de micro-proyección de imagen de ultrasonido de alta frecuencia12. Previamente hemos demostrado que medición de la trombosis venosa por ultrasonido se correlaciona favorablemente con trombos obtenidos patológico. En dos estudios posteriores hemos comprobado que las medidas obtenidas con ultrasonido se correlacionan con el peso del trombo y trombo área cuantificada por histoquímica9,10. Más importante aún, hemos demostramos que ultrasonido de alta frecuencia puede utilizarse para supervisar la formación de trombosis venosa profunda en ratones12. También puede utilizarse para cuantificar la resolución del trombo en forma no invasiva.
Aquí, describimos el protocolo que permite la formación del trombo utilizando el modelo de ratón de trombosis inducida por estasis y como formación de trombos puede ser supervisada no invasiva sobre tiempo utilizando ultrasonido de alta frecuencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos fundamentales para la formación del trombo venoso exitosa utilizando el modelo de estasis. Inducción de trombosis de la vena es más difícil en los ratones viejos debido a la acumulación de grasa alrededor de la vena cava inferior y la aorta. Idealmente, los ratones sometidos a este procedimiento deben ser 8 – 10 semanas de edad. Debe tenerse gran cuidado no para inducir daño endotelial en la vena cava inferior durante la disección Roma y ligadura. Además, es crucial para mantener el animal en una…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una donación del corazón y accidente cerebrovascular Fundación de Canadá y por la Morris y Bella Fainman Family Foundation. Los autores desean agradecer a Michaud Veronique por su ayuda técnica con el sistema de proyección de imagen de ultrasonido de VEVO770.
Materials
| 6-0 perma-hand silk suture | Ethicon | 706G | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| blunt forceps (straight and curved) | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Moria Spring Scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| 1ml syringes | BD Biosciences | ||
| 26G needles | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 High Resolution Imaging System | Visualsonics | No longer sold | |
| SR Buprenorphine | ZooPharm | Given to LDI by Vet | |
| Surgery Microscope | Leica | Leica M651 | |
| Systan eye oinment | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2×2 sterile Gauze | CDMV | #104148 | |
| Cotton Tip Applicators | from JGH | ||
| Transpore hypoallergenic surgical tape | CDMV | #7411 | |
| Ultrasound gel (Aquasonic-100) | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| Incubator | From JGH | ||
| Isoflurane | Dispomed | ||
| Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment | Dispomed | ||
| Hair remover | Nair | ||
| Water heated hard pad | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Gaymar heater water pump TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| Infra-red heating lamp | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| Mouse rectal temperature prope | emkaTECHNOLOGIES | ||
| Sterile water | From JGH |
Referências
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