Antibiotikaresistens i bakterier er en større sundhed problem¹. På et grundlæggende niveau er udbredelsen af antibiotisk resistens i patogene bakterier et simpelt eksempel på evolution ved naturlig udvælgelse^2,3. Put blot, genererer brugen af antibiotika udvalg for resistente bakteriestammer. Et centralt problem i evolutionær biologi, er derfor at forstå de faktorer, der påvirker evnen af bakteriel befolkning at udvikle resistens over for antibiotika. Udvalg eksperimenter er dukket op som en meget kraftfuldt værktøj til at undersøge den evolutionære biologi af bakterier, og feltet har produceret utrolig indsigt i en bred vifte af evolutionære problemer^4,5,6. I eksperimentel udvikling, er bakteriel populationer startet fra en enkelt forældrenes stamme seriefremstillede passaged defineret og stramt kontrollerede betingelser. Nogle af de mutationer, der opstår under væksten af disse kulturer øge bakteriel fitness, og disse spredes gennem kulturer ved naturlig udvælgelse. Under eksperimentet, er prøver af befolkningerne periodisk cryogenically bevaret for at skabe en ikke-udviklende frosne levesteder. En lang række metoder kan bruges til at karakterisere udvikler sig bakteriel befolkninger, men de to mest almindelige metoder er fitness assays, der måler udviklet bakterier evne til at konkurrere mod deres fjerne forfædre, og hele genome sequencing, der er bruges til at identificere de genetiske ændringer at drive tilpasning. Efter banebrydende arbejde Richard Lenski og kolleger^7,8, standardmetoden i eksperimentel udvikling har været at udfordre et relativt lille antal Repliker populationer (typisk < 10) med tilpasning til en ny miljømæssige udfordringer, såsom nye CO2-kilder, temperatur eller en aggressiv phage.

Infektioner forårsaget af antibiotika-resistente bakterier blive et stort problem, når modstand er høj nok, at det ikke er muligt at øge antibiotikum koncentrationen til dødelige niveauer i patient væv. Klinikere er derfor interesseret i hvad gør det muligt for bakterier til at udvikle resistens over for høje doser af antibiotika, der ligger over denne tærskel antibiotikum koncentration, den kliniske pausepunkt. Hvordan man studerer dette eksperimentelt? Hvis et lille antal af bakteriel befolkning er udfordret med en høj dosis af antibiotika, som i en Lenski-stil er eksperimentet, så det mest sandsynlige resultat at antibiotika vil drive alle befolkningerne til at uddø. På samme tid, hvis dosis af antibiotika, der anvendes er lav, under den minimale hæmmende koncentration (MIC) af forældrenes stammen, er det usandsynligt, at de bakterielle befolkninger vil udvikle sig klinisk relevante niveauer af modstand, især hvis modstand bærer en store omkostninger. Et kompromis mellem disse to scenarier er at bruge en “evolutionære rescue” eksperiment^9,10,11. I denne tilgang, et meget stort antal kulturer (typisk > 40) udfordres med doser af antibiotika, der stige over tid, typisk ved at fordoble antibiotikum koncentration hver dag¹². Kendetegnende for dette eksperiment er, at en befolkning, der ikke udvikles øget modstand vil være tvunget til at uddø. De fleste populationer, der bliver udfordret på denne måde vil blive drevet uddød, men et lille mindretal bliver stadig af udvikler sig høje niveauer af resistens. I dette papir viser vi, hvordan denne eksperimentelle design kan bruges til at undersøge flerkopiværktøj plasmid bidrag til udviklingen af resistens.

Bakterier erhverve antibiotikaresistens gennem to vigtigste ruter, kromosomale mutationer og erhvervelse af mobile genetiske elementer, for det meste plasmider¹³. Plasmider spiller en central rolle i udviklingen af antibiotikaresistens, fordi de er i stand til at overføre resistensgener mellem bakterier af konjugation^14,15. Plasmider kan opdeles i to grupper efter deres størrelse og Biologi: “små”, med høj kopi nummer pr. bakteriel celle og “store”, med lav kopier nummer^16,17. Rollen som store plasmider i udviklingen af antibiotikaresistens er dokumenteret grundigt, fordi de omfatter konjugering plasmider, som er de vigtigste drivkræfter for formidling af modstand og multi modstand blandt bakterier¹⁵. Lille flerkopiværktøj plasmider er også meget udbredt i bakterier^17,18, og de kode ofte for antibiotisk resistens gener¹⁹. Men rollen som små flerkopiværktøj plasmider i udviklingen af antibiotikaresistens er blevet undersøgt i et mindre omfang.

I en nylig arbejde, vi har foreslået at flerkopiværktøj plasmider kunne fremskynde udviklingen af de gener, de bærer ved at øge gene mutation satser på grund af højere gen kopi antallet pr. celle¹². Ved hjælp af en eksperimentel model med E. coli stamme MG1655 og β-lactamase-gen bla_TEM-1 blev det vist, at flerkopiværktøj plasmider accelereret satsen for udseendet af TEM-1 mutationer giver resistens over for den tredje generations cephalosporin ceftazidime. Disse resultater viste, at flerkopiværktøj plasmider kan spille en vigtig rolle i udviklingen af antibiotikaresistens.

Vi præsenterer her, en detaljeret beskrivelse af den metode, vi har udviklet sig til at undersøge den flerkopiværktøj plasmid-medieret evolution af antibiotikaresistens. Denne metode har tre forskellige trin: første, indsættelse af gen under undersøgelse enten i en flerkopiværktøj plasmid eller kromosom af vært bakterierne. Andet, brug af eksperimentelle evolution (evolutionære rescue) til at vurdere de forskellige stammer til at tilpasse sig til det selektive pres. Og tredjedel, fastlægge det molekylære grundlag underliggende plasmid-medieret evolution ved hjælp af DNA sekvensering og rekonstruere de formodede mutationer individuelt i forældrenes genotype.

Endelig, selv om protokollen beskrevet her var designet til at undersøge udviklingen af antibiotikaresistens, kan man hævde, at denne metode kunne være generelt nyttige til at analysere udviklingen af innovationer erhvervet af mutationer i et udskriftsjob plasmid-kodede genet.