Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido usada como um organismo modelo para pesquisa genética para mais de um século¹. O estudo deste organismo não deu origem apenas significativo conhecimento fundamental sobre herança ligada ao sexo², taxa de mutação³, o desenvolvimento do sistema neural e o celular destino determinação⁴, mas também recentemente emergiu como um ferramenta valiosa para estudar os mecanismos inerentes à várias doenças como Alzheimer e Parkinson^5,6. Além disso, é um modelo popular para estudar o processo de envelhecimento, como eles podem ser levantados em grande número durante um curto período de tempo e têm vida curta. Eles também possuem estruturas homólogas de órgãos humanos, tais como um coração, oenocytes (hepatócitos células), corpos de gordura (funcionando da mesma forma como o tecido adiposo branco e fígado), células (equivalentes a células β-pancreáticas), produtoras de insulina, bem como a hemolinfa transporta metabólitos (análogo ao sangue de vertebrados)⁷. Além disso, as vias centrais do metabolismo intermediário (incluindo o fator de crescimento insulina/insulin-like, como via de sinalização e vias de alvo de rapamicina-TOR) também são altamente conservadas⁷. Por estas razões, a drosófila recentemente têm sido explorados para descrever os mecanismos fundamentais que controlam o metabolismo, especialmente em condições patológicas inerentes ao humanas doenças metabólicas tais como diabetes,⁸. Um componente importante do metabolismo é a mitocôndria que integra múltiplos caminhos e executa uma das mais importantes funções biológicas de vida, produção de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa (OXPHOS). Considerando seu papel central no metabolismo do organismo, não é de estranhar que disfunções mitocondriais estão envolvidas em muitas doenças como^{9 a doença de Parkinson} e doenças de Alzheimer¹⁰, bem como na esclerose lateral amiotrófica ^{11 , 12}. eles também são determinantes fundamentais do processo de envelhecimento. Na verdade, eles são os principais produtores de espécies reativas de oxigênio (ROS) na célula, que pode ser prejudicial para a célula em alta concentração através de de danos oxidativos¹¹. Envelhecimento também tem sido associado à acumulação de danificado ou mutado DNA mitocondrial¹³, mitophagy disfunções^14,15 , bem como o comprometimento da biogênese mitocondrial¹⁶. As mitocôndrias são também determinantes da homeostase da célula como eles podem utilizar diferentes substratos para ajustar várias funções celulares, de acordo com a abundância ou escassez de macronutrientes^17,18.

Com efeito, os diferentes nutrientes na dieta (carboidratos, lipídios e proteínas) são digeridos, absorvidos e transportados nas células. Eles são então transformados no citosol, e os substratos derivados são transportados para a matriz mitocondrial, onde produzem equivalentes redutores, tais como NADH e DANIII₂¹⁹. Estes redutores equivalentes são então oxidados por complexos enzimáticos diferentes do sistema de transporte de elétrons (ETS). Estes complexos são incorporados na membrana mitocondrial interna, tais como complexo I e II do complexo. Além disso, outros complexos enzimáticos, tais como o glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial e a desidrogenase de prolina representam rotas alternativas para a entrada de elétrons para o ETS^20,21. Estes complexos ‘alternativos’ são particularmente importantes em insetos, como de acordo com a espécie, eles podem participar activamente para aumentar a respiração^20,22,23,21. Elétrons destes ETS sistemas de alimentação são transferidos para a ubiquinona e posteriormente ao complexo III e depois para o complexo IV, até o aceitador final, oxigênio molecular. Esta transferência de elétrons gera uma força motriz protónica através da membrana mitocondrial interna, dirigindo a fosforilação do ADP a ATP a complexo V (Figura 1). Considerando o papel central da mitocôndria na homeostase da célula, estudar o metabolismo mitocondrial, usando o modelo relevantes d. melanogaster representa uma ferramenta poderosa para delinear os mecanismos subjacentes de vário fisiopatológicos condições ou sob tensões ambientais e celulares. Surpreendentemente, no entanto, apenas um punhado de estudos efectivamente medidos respiração mitocondrial em Drosophila^24,25,26. De fato, experimentos com o objetivo de avaliar o consumo de oxigênio mitocondrial exigem o isolamento da mitocôndria. Apesar de vantajoso para a medição de diferentes funções mitocondriais (tais como a produção de ROS ou P/O rácio como marcador de eficiência mitocondrial^27,28), estes isolamentos geralmente requerem quantidades bastante grandes de tecido de vários indivíduos^24,29. Este requisito para grandes quantidades de tecido e indivíduos é um importante fator limitante, especialmente considerando que todos os indivíduos devem ter a mesma idade e de preferência do mesmo sexo para os experimentos, tornando a medida da respiração em horário diferente na melhor das hipóteses, aponta laborioso. Além disso, enquanto os isolamentos mitocondriais podem fornecer insights significativos sobre os mecanismos fundamentais que regulam o metabolismo mitocondrial, os métodos usados para isolar as mitocôndrias têm várias desvantagens como a dificuldade de obter resultados replicáveis , interrupção da rede mitocondrial e alteração da mitocondrial estrutura e função de^29,30,31.

O objetivo deste estudo é apresentar um protocolo robusto para medir o consumo de oxigênio mitocondrial em drosófila usando apenas uma quantidade mínima de tecido de muito poucos indivíduos. Esse protocolo consiste em medir o oxigênio mitocondrial consumo em situ usando permeabilized fibras musculares²⁹ de avermelhado de Drosophila em combinação com alta resolução respirometria^{32,33, 34 , 35}. este método também tem vantagens adicionais em comparação com o método clássico de isolamento mitocondrial desde as interações com os outros componentes da célula, como bem como mitocondrial estrutura e função são mais preservadas em permeabilizado fibras^29,31,36, que faz com que esta abordagem mais fisiologicamente relevantes. Com este protocolo, funções mitocondriais podem ser exatamente avaliadas usando respirometria de alta resolução em apenas três avermelhado de Drosophila, com substratos, permitindo a determinação do consumo de oxigênio em várias etapas diferentes do RCE. Portanto, este protocolo poderia ajudar a responder questões chave sobre os mecanismos fundamentais que controlam o metabolismo no contexto de muitas condições ambientais ou fisiopatológicos, aproveitando o modelo de Drosophila.

Para medir o consumo de oxigênio em várias etapas diferentes do RCE e avaliar como diferentes substratos contribuem para a respiração, diferentes substratos (Figura 1), desacoplador e inibidores são usados³⁰ após a permeabilização do tecido. Especificamente, adições sequenciais de diferentes substratos são realizadas para estimular a entrada de elétrons através dos complexos diferentes do RCE. Um desacoplador, cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP), então é adicionado na concentração ideal para medir a respiração não acoplados, ou seja, a respiração não-pressões estimuladas ao consumo máximo de oxigênio. Inibições sequenciais dos complexos que i, II e III são, em seguida, executada para monitorar o consumo de oxigênio residual que é devido a reações de oxidação não-ETS. Finalmente, a capacidade de respiração máxima complexa IV pode ser avaliada através da injeção de N, N, N’, N, – tetrametil – p-fenilenodiamina (TMPD), um provedor de elétron artificial e ascorbato. É importante notar que as experiências são conduzidas a 24 °C, desde que é a temperatura em que as moscas são geradas.