ऊतक की न्यूनतम मात्रा का उपयोग Drosophila के Permeabilized फाइबर में Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का मापन
Summary
इस पत्र में, Drosophila के permeabilized thoraxes में उच् च संकल् respirometry का प्रयोग करते हुए ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए एक विधि बताई गई है । इस तकनीक को क्लासिक mitochondrial अलगाव तकनीक की तुलना में ऊतक की एक ंयूनतम राशि की आवश्यकता है और प्राप्त परिणाम अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं ।
Abstract
फल मक्खी, Drosophila melanogaster, चयापचय के अध्ययन के लिए एक उभरते मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है । दरअसल, drosophila मानव अंगों के लिए मुताबिक़ संरचनाओं है, अत्यधिक संरक्षण चयापचय रास्ते के अधिकारी और एक अपेक्षाकृत कम उंर है कि समय की एक छोटी अवधि में विभिंन बुनियादी तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है । यह है, तथापि, आश्चर्य की बात है कि सेलुलर चयापचय के लिए आवश्यक तंत्र में से एक, mitochondrial श्वसन, अच्छी तरह से इस मॉडल में जांच नहीं की गई है । यह संभावना है क्योंकि Drosophila में mitochondrial श्वसन के उपाय आम तौर पर व्यक्तियों की एक बहुत बड़ी संख्या की आवश्यकता है और प्राप्त परिणाम अत्यधिक reproducible नहीं हैं । यहां, Drosophila से ऊतक की ंयूनतम मात्रा का उपयोग कर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का सटीक माप की अनुमति विधि वर्णित है । इस विधि में thoraxes और permeabilized दोनों यांत्रिक रूप से तेज संदंश और saponin के साथ रासायनिक, कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए विभिन्न यौगिकों की अनुमति और mitochondrial श्वसन का नियमन कर रहे हैं । permeabilization के बाद, एक प्रोटोकॉल के लिए इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ETS) के विभिंन परिसरों की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए विभिंन सब्सट्रेट ऑक्सीकरण, साथ ही साथ अपनी प्रतिक्रिया के लिए किया जाता है एक unयुग्मक और कई अवरोधकों के लिए । इस विधि mitochondrial अलगाव का उपयोग कर तरीकों की तुलना में कई लाभ प्रस्तुत करता है, क्योंकि यह अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि mitochondria अभी भी अंय सेलुलर घटकों के साथ बातचीत कर रहे है और mitochondrial आकृति विज्ञान संरक्षित है । इसके अलावा, नमूना तैयारी तेजी से कर रहे हैं, और प्राप्त परिणाम अत्यधिक reproducible हैं । mitochondrial श्वसन के मूल्यांकन के साथ चयापचय के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में Drosophila के लाभ के संयोजन से, महत्वपूर्ण नए अंतर्दृष्टि का अनावरण किया जा सकता है, खासकर जब मक्खियों अलग पर्यावरण या pathophysiological का सामना कर रहे है शर्तों.
Introduction
फल मक्खी, Drosophila melanogaster, एक सदी1से अधिक के लिए आनुवंशिक अनुसंधान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है । इस जीव का अध्ययन न केवल सेक्स के बारे में महत्वपूर्ण मौलिक ज्ञान के लिए नेतृत्व किया है विरासत2, उत्परिवर्तन दर3, तंत्रिका तंत्र के विकास और सेल भाग्य निर्धारण4, लेकिन यह भी हाल ही में एक के रूप में उभरा महत्वपूर्ण उपकरण जैसे अल्जाइमर और पार्किंसंस5,6के रूप में कई रोगों के लिए अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए । इसके अलावा, यह उंर बढ़ने की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल है, क्योंकि वे समय की एक छोटी अवधि में बड़ी संख्या में उठाया जा सकता है और एक छोटी उंर है । वे भी मानव अंगों को मुताबिक़ संरचनाओं के अधिकारी, जैसे एक दिल, oenocytes (hepatocyte की तरह कोशिकाओं), वसा शरीर (जिगर और सफेद वसा ऊतक के रूप में इसी तरह कार्य), इंसुलिन का उत्पादन कोशिकाओं (β-अग्नाशय कोशिकाओं के बराबर), के रूप में अच्छी तरह के रूप में hemolymph परिवहन चयापचयों (रीढ़ के रक्त के अनुरूप)7। इसके अलावा, मध्यस्थ चयापचय के केंद्रीय मार्ग (सहित इंसुलिन/इंसुलिन की तरह विकास कारक-संकेतन मार्ग और Rapamycin-टो रास्ते के लक्ष्य) भी अत्यधिक संरक्षण कर रहे हैं7. इन कारणों के लिए, Drosophila हाल ही में मौलिक तंत्र है कि नियंत्रण चयापचय, विशेष रूप से रोग की स्थिति में इस तरह के मधुमेह के रूप में मानव चयापचय रोगों के लिए निहित का वर्णन करने के लिए शोषण किया गया है8। चयापचय का एक प्रमुख घटक mitochondrion है कि कई रास्ते को एकीकृत करता है और जीवन की सबसे महत्वपूर्ण जैविक कार्यों में से एक है, एटीपी उत्पादन, ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण प्रक्रिया (OXPHOS) के माध्यम से । जीव के चयापचय में उनकी केंद्रीय भूमिका को ध्यान में रखते हुए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि mitochondrial रोग पार्किंसंस की9 और अल्जाइमर रोगों की तरह कई रोगों में शामिल कर रहे हैं10, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पेशीशोषी पार्श्व में स्केलेरोसिस 11 , 12. वे भी उंर बढ़ने की प्रक्रिया के मौलिक निर्धारक हैं । दरअसल, वे सेल में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के मुख्य निर्माता हैं, जो ऑक्सीडेटिव हर्जाना11के माध्यम से उच्च एकाग्रता पर कोशिका के लिए हानिकारक हो सकते हैं । उंर बढ़ने भी क्षतिग्रस्त या रूपांतरित mitochondrial डीएनए के संचय के लिए संबद्ध किया गया है13, mitophagy रोग14,15 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mitochondrial उत्पत्ति16की हानि । Mitochondria भी है सेल homeostasis के प्रमुख निर्धारकों के रूप में वे विभिंन सब्सट्रेट का उपयोग करने के लिए बहुतायत या macronutrients17,18की कमी के अनुसार कई सेलुलर कार्यों को समायोजित कर सकते हैं ।
दरअसल, आहार में विभिन्ना पोषक तत्व (कार्बोहाइड्रेट, लिपिड और प्रोटीन) पचता, अवशोषित और कोशिकाओं में पहुँचाया जाता है. वे तो cytosol में तब्दील हो जाते हैं, और व्युत्पंन सब्सट्रेट mitochondrial मैट्रिक्स में ले जाया जाता है जहां वे बराबरी को कम करने का उत्पादन, जैसे नध और फॊध219. ये कम करने के समकक्ष तो इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ETS) के विभिंन एंजाइमी परिसरों से ऑक्सीकरण हो रहे हैं । इन परिसरों में mitochondrial भीतरी झिल्ली, जैसे जटिल मैं और जटिल द्वितीय में एंबेडेड हैं । इसके अतिरिक्त, अंय एंजाइमी परिसरों जैसे mitochondrial ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज और डिहाइड्रोजनेज के लिए वैकल्पिक मार्गों में इलेक्ट्रॉनों की प्रविष्टि के लिए ETS20,21का प्रतिनिधित्व करते हैं । इन ‘ विकल्प ‘ परिसरों कीड़ों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, प्रजातियों के अनुसार के रूप में, वे सक्रिय रूप से श्वसन20,22,23,21को बढ़ाने के लिए भाग ले सकते हैं । इन ETS खिला प्रणालियों से इलेक्ट्रॉनों ubiquinone को हस्तांतरित कर रहे है और बाद में जटिल III के लिए, और फिर जटिल चतुर्थ करने के लिए, अंतिम स्वीकारकर्ता, आणविक ऑक्सीजन तक । यह इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण इनर mitochondrial झिल्ली भर में एक प्रोटॉन-मकसद बल उत्पंन करता है परिसर V में एटीपी के लिए ADP के फास्फारिलीकरण ड्राइविंग (चित्रा 1) । सेल के homeostasis में mitochondria की केंद्रीय भूमिका को ध्यान में रखते हुए, mitochondrial चयापचय का अध्ययन प्रासंगिक मॉडल डी. melanogaster का उपयोग करते हुए विभिन्न चित्रित के अंतर्निहित तंत्रों को pathophysiological करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है शर्तों या सेलुलर और पर्यावरण तनाव के तहत । आश्चर्य की बात है लेकिन, केवल अध्ययन के एक मुट्ठी भर वास्तव में Drosophila24,25,26में mitochondrial श्वसन मापा । दरअसल, प्रयोगों mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का मूल्यांकन करने के लिए लक्ष्य mitochondria के अलगाव की आवश्यकता है । हालांकि अलग mitochondrial कार्यों की माप के लिए लाभप्रद (जैसे ROS उत्पादन या mitochondrial दक्षता के मार्कर के रूप में पी/ओ अनुपात27,28), इन अलगाव आम तौर पर बल्कि बड़ी मात्रा की आवश्यकता कई व्यक्तियों24,29से ऊतक के । ऊतक और व्यक्तियों की उच्च मात्रा के लिए यह आवश्यकता एक महत्वपूर्ण सीमित कारक है, विशेष रूप से विचार है कि सभी व्यक्तियों को एक ही उंर और प्रयोगों के लिए एक ही लिंग के अधिमानतः होना चाहिए, अलग समय पर श्वसन के उपाय कर अंक श्रमसाध्य पर उत्तम । इसके अलावा, जबकि mitochondrial अलगाव mitochondrial चयापचय गवर्निंग बुनियादी तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, mitochondria को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों replicable परिणाम प्राप्त करने के लिए कठिनाई के रूप में कई कमियां है , mitochondrial नेटवर्क के विघटन, और mitochondrial संरचना और समारोह में परिवर्तन29,30,31।
इस अध्ययन का उद्देश्य Drosophila में mitochondrial ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल वर्तमान बहुत कम व्यक्तियों से ऊतक का केवल एक ंयूनतम राशि का उपयोग कर रहा है । इस प्रोटोकॉल को मापने के होते है सीटू में mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का उपयोग कर permeabilized मांसपेशी फाइबर29 Drosophila thoraxes से उच्च संकल्प respirometry32,33के साथ संयोजन में, 34 , 35. इस विधि के साथ ही mitochondrial संरचना और फ़ंक्शन अधिक संरक्षित हैं permeabilized में सेल के अन्य घटकों के साथ बातचीत के बाद से क्लासिक mitochondrial आइसोलेशन विधि की तुलना में भी अतिरिक्त लाभ है 29फाइबर,31,36, जो इस दृष्टिकोण को और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक बनाता है । इस प्रोटोकॉल के साथ, mitochondrial कार्यों सही Drosophila के केवल तीन thoraxes में उच्च संकल्प respirometry का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, सब्सट्रेट ETS के कई विभिन्न चरणों में ऑक्सीजन की खपत के निर्धारण की अनुमति के साथ. इसलिए, इस प्रोटोकॉल मदद कर सकता है बुनियादी तंत्र है कि Drosophila मॉडल का लाभ लेने के द्वारा कई पर्यावरणीय या pathophysiological शर्तों के संदर्भ में नियंत्रण चयापचय के बारे में महत्वपूर्ण सवालों का जवाब ।
ETS के कई विभिंन चरणों में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए और मूल्यांकन कैसे विभिंन सब्सट्रेट श्वसन, विभिंन सब्सट्रेट (चित्रा 1), unयुग्मक, और अवरोधकों के लिए योगदान के permeabilization के बाद30 का उपयोग कर रहे है ऊतक. विशेष रूप से, विभिन्न सब्सट्रेट के अनुक्रमिक जोड़ ETS के विभिन्न परिसरों के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों के प्रवेश को प्रोत्साहित करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. एक uncarbonyl, साइनाइड 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), तो इष्टतम एकाग्रता को मापने के लिए गैर-संवेदनाएं, यानी, गैर phosphorylating श्वसन के लिए अधिक से अधिक ऑक्सीजन की खपत को प्रेरित में जोड़ा है । परिसरों मैं, द्वितीय और III के अनुक्रमिक संकोच तो अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत है कि गैर ETS ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं के कारण है की निगरानी करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । अंत में, जटिल चतुर्थ अधिकतम श्वसन क्षमता के इंजेक्शन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता n, n, n ‘, n,-Tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD), एक कृत्रिम इलेक्ट्रॉन प्रदाता, और ascorbate. यह ध्यान रखें कि प्रयोगों 24 डिग्रीसी पर आयोजित कर रहे है क्योंकि यह तापमान जिस पर मक्खियों उठाया है महत्वपूर्ण है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, Drosophila में mitochondrial ऑक्सीजन खपत की माप से पहले नमूना तैयारी के लिए एक विधि बताई गई है. इस विधि mitochondrial अलगाव का उपयोग प्रोटोकॉल से संबंधित विभिंन समस्याओं को दूर करने के लिए विकसित किया गया था, विशे?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन राष्ट्रीय विज्ञान एवं अभियांत्रिकी अनुसंधान परिषद् (NSERC, डिस्कवरी अनुदान) और विश्विद्यालय डी मॉन्कटन से एनपीई को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. LHB को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), ंयू ब्राउनश्विक इनोवेशन फाउंडेशन (NBIF) और विश्विद्यालय डे मॉन्कटन से फंडिंग सपोर्ट स्वीकार करना चाहूंगा । EHC के काम को कनाडा, ब्रेन कनाडा, NSERC, कैनेडियन ब्रेस्ट कैंसर फाउंडेशन, न्यू ब्राउनश्विक इनोवेशन फाउंडेशन, न्यू ब्राउनश्विक हेल्थ रिसर्च फाउंडेशन और विश्विद्यालय डे मॉन्कटन के अल्जाइमर्स सोसायटी द्वारा सपोर्ट किया जाता है ।
Materials
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
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