조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

과일 파리, 초파리 melanogaster 사용 되었습니다 모델 생물으로 서 유전자 연구에 대 한¹세기 이상. 이 유 기체의 연구만 sex-linked 상속², 돌연변이 속도³, 신경 시스템의 개발 및 세포 운명 결정⁴에 대 한 중요 한 기초 지식을 주도 하지 않은 하지만 또한 최근 등장으로 Alzheimer와 Parkinson의^5,6등 여러 질병에 고유의 메커니즘을 연구를 유용한 도구입니다. 또한, 그들은 시간의 짧은 기간 동안 많은 수에서 올려질 수 있고 짧은 수명으로 노화 과정을 공부 하는 인기 있는 모델입니다. 그들은 또한 인간의 장기는 심장, oenocytes (hepatocyte 같은 셀), 지방 기관 (간 및 백색 지방 조직으로 유사 하 게 작동), 인슐린 생산 세포 (췌 장 β 세포에 해당), 동종 구조를가지고 뿐만 아니라 hemolymph 수송 대사 산물 (척추 동물의 혈액과 유사)⁷. 또한, 중앙 통로 중간 대사 (인슐린/인슐린 같은 성장 인자와 같은 신호 통로 및 대상의 Rapamycin-토르 경로 포함)의 높은 보존된⁷있습니다. 이러한 이유로 초파리 최근 당뇨병⁸등 인간의 신진 대사 질환에 병 적인 조건에서 특히 신진 대사를 제어 하는 기본 메커니즘을 설명 하기 위해 개발 되었습니다. 물질 대사의 주요 구성 요소는 mitochondrion 여러 경로 통합 하 고 생활의 가장 중요 한 생물 학적 기능 중 하나를 수행 하는 (OXPHOS) 산화 인 산화 과정을 통해 ATP 생산. 생물의 물질 대사에 있는 그들의 중추적인 역할을 고려 하면 그것은 놀라운 미토 콘 드 리아 장애 루 경화 증 뿐만 아니라 파 킨 슨 병⁹ , Alzheimer 질병¹⁰, 같은 많은 질병에 관련 된 ^{11 , 12}. 그들은 또한 노화 과정의 근본적인 결정 요인. 실제로, 그들은 산화 손상¹¹높은 농도에서 세포에 해로운 수 셀 반응성 산소 종 (선생님)의 주요 생산자. 노화 또한 미토 콘 드리 아 속¹⁶의 손상 뿐만 아니라 손상 된 돌연변이 미토 콘 드리 아 DNA¹³, mitophagy 장애^14,15 의 축적에 연결 되었습니다. 미토 콘 드리 아는 또한 세포의 항상성의 주요 결정 요인 그들은 풍부 또는 부족 macronutrients^17,18의 여러 세포 기능을 조정 하려면 다른 기질을 이용할 수 있다.

실제로, 다른 영양소 (탄수화물, 지질 및 단백질) 다이어트에는 소화, 흡수와 세포에 수송. 그들은 다음, cytosol에 변화 그리고 파생된 기판 그들이 있는 줄이는 해당 하는 NADH와 FADH₂¹⁹를 생산 하는 미토 콘 드 리아 매트릭스로 이송 됩니다. 이러한 감소 등가물은 다음 전자 교통 시스템 (ETS)의 다른 효소 복합물에 의해 산화 된다. 이 단지는 복잡 한 같은 미토 콘 드리 아 내 막에 포함 된 복잡 한 제. 또한, 미토 콘 드리 아 글리세롤 3 인산 염 효소, 프롤린 효소 등 효소 다른 단지 ETS^20,21에 전자의 항목에 대 한 대체 경로 나타냅니다. ‘대안’이 단지는 곤충, 특히 중요 한으로 종에 따라 그들은 적극적으로 참여할 수 호흡^20,,2223,21증가 하. 전자 시스템을 먹이이 ETS에서 마지막 수락자 분자 산소까지는 ubiquinone 및 이후 복잡 한 iii, 그리고 복잡 한 4, 전송 됩니다. 이 전자 전송 안 미토 콘 드리 아 막 복잡 한 V (그림 1)에서 ATP를 ADP의 인 산화를 운전에 걸쳐 양성자 동기 힘을 생성 합니다. 세포의 항상성, 미토 콘 드리 아 대사 관련 모델 D. melanogaster 대표를 사용 하 여 공부에 미토 콘 드리 아의 역할의 다양 한 기본 메커니즘의 윤곽을 그리 다 수 있는 강력한 도구 pathophysiological 고려 조건 또는 셀룰러 및 환경 스트레스. 그러나 의외로, 소수의 연구만 실제로 측정 초파리^24,,2526에서 미토 콘 드리 아 호흡. 실제로, 미토 콘 드 리아 산소 소비를 평가 하는 것을 목표로 실험 미토 콘 드리 아의 격리가 필요 합니다. 다른 미토 콘 드리 아 기능 (예: 선생님 생산 또는 미토 콘 드 리아 효율^27,28의 표식으로 P/O 비율)의 측정에 대 한 유리, 이러한 격리는 일반적으로 오히려 다량 필요 조직의 여러 개인^24,29에서. 조직과 개인의 높은 금액에 대 한이 요구는 중요 한 제한 요소, 특히 모든 개인이 같은 나이 이어야 한다 고려 하 고 가급적 실험에 대 한 동일한 성의 다른 시간에 호흡 측정을 만들기 최상의 힘 드는 포인트. 또한, 미토 콘 드 리아 격리 미토 콘 드리 아 대사를 경 세 하는 기본적인 기계 장치에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 하는 방법 복제 하기 어려움 등 여러 단점을가지고 미토 콘 드리 아 네트워크, 그리고 미토 콘 드리 아 구조와 기능^29,,3031의 변경의.

이 연구의 목적은 최소한의 양의 아주 몇몇 개인에서 조직만을 사용 하 여 초파리에 미토 콘 드리 아 산소 소비량을 측정 하는 강력한 프로토콜을 제시 하는 것입니다. 이 프로토콜의 미토 콘 드리 아 산소 소비에서 제자리에 고해상도 respirometry^32,33, 와 함께에서 permeabilized 근육 섬유²⁹ 초파리 직업적인에서를 사용 하 여 측정 구성 ^{34 , 35}.이 메서드는 또한 추가적인 장점 때문에 셀의 다른 구성 요소와 상호 작용으로 잘으로 미토 콘 드리 아의 구조와 기능에 더 보존 permeabilized 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 방법에 비해 섬유^29,,3136,이 접근을 더 순수 관련 시키는. 이 프로토콜, 미토 콘 드 리아 기능 수 있습니다 정확 하 게 평가 초파리의 3 개의 직업적인 ETS의 몇 가지 다른 단계에서 산소 소비의 결심을 허용 하는 기판으로 고해상도 respirometry를 사용 하 여. 따라서,이 프로토콜은 초파리 모델을 활용 하 여 많은 환경 또는 병 태 생리 조건에서 대사를 제어 하는 기본 메커니즘에 대 한 주요 질문에 답변을 도울 수 있었다.

하는 ETS의 몇 가지 다른 단계에서 산소 소비량을 측정 하 고 어떻게 다른 기판 평가 호흡, 다른 기판 (그림 1), uncoupler을 그리고 억제제 사용된³⁰ 의 permeabilization 후에 조직입니다. 특히, 다른 기판의 순차적 추가 자극 하는 ETS의 다른 단지를 통해 전자의 항목을 수행 됩니다. uncoupler 생성 시안 화물 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), 비 결합 호흡을 측정 하기 위해 최적의 농도에 추가, 즉, phosphorylating 비 호흡 극대 산소 소비를 자극. I, II, 및 III 다음 비 ETS 산화 반응으로 인해 잔여 산소 소비를 모니터링을 수행 하는 단지의 순차적 임무 N, N, N의 주입에 의해 복잡 한 IV 최대한 호흡 능력을 평가 하는 마지막으로,’, N-Tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD)는 인공 전자 업체, 그리고 하는데. 그것은 그것 이기 때문에 파리는 발생 하는 온도 실험 24 °C에서 실시 하는 것을 주의 하는 것이 중요.