Isolation og kultur af primær epikardielle celler, der stammer fra menneskelige voksen og fostrets hjerte prøver

Epicardium, en enkelt celle epitel lag at konvolutter hjertet, er af vital betydning for udvikling af hjerte og reparation (gennemgik i Smits et al. ¹). udviklingshæmmede, epicardium udspringer af proepicardial orglet, en lille struktur placeret i bunden af den udvikle hjerte. Omkring udviklingsmæssige dag E9.5 i mus, og 4 uger efter undfangelse i menneskelige begynde cellerne at migrere fra denne blomkål struktur og dække den udvikle myokardiet². Når en enkelt epitelcelle lag er dannet, gennemgår en del af de epikardielle celler epitelial mesenchymale overgangen (EMT). Under EMT, celler mister deres epitelial egenskaber, såsom celle-celle sammenvoksninger, og opnå en mesenchymale fænotype, som giver dem evnen til at overflytte til udviklingslandene myokardiet. De dannede epikardielle afledte celler (EPDCs) kan udvikle sig til flere hjerte celletyper, herunder fibroblaster, glatte muskelceller, og potentielt cardiomyocytes og endotelceller³, selv om differentiering af sidstnævnte to celle befolkningsgrupper er stadig genstand for debat (gennemgik i Smits et al. ⁴). Derudover epicardium giver lærerigt paracrine signaler at myokardiet at regulere dens vækst og vascularization^5,6,7,8. Flere undersøgelser har vist, at nedsat epikardielle dannelse fører til udviklingsmæssige mangler i hjertemuskulaturen^9,10, vaskulatur¹¹og varmeledning system¹², understreger væsentlige bidrag af epicardium til dannelsen af hjertet.

Selv om voksen midt i epicardium er til stede som en sovende lag, bliver det genaktiveret ved iskæmi¹³. Epikardielle reaktivering efter skade sammenfatter flere af processerne beskrevet for kardiale udvikling, herunder spredning og EMT¹⁴, omend mindre effektivt. Interessant, selv om de nøjagtige mekanisme ikke er fuldt forstået, de epikardielle bidrag til at reparere kan forbedres ved behandling med fxThymosin β4¹⁵ eller ændret VEGF-A mRNA¹⁶, hvilket resulterer i afhjælpes hjerte funktionen efter myokardieinfarkt. Epicardium er derfor en interessant celle kilden øge endogen reparation af de sårede hjerte.

Mekanismer af cardiac udvikling er ofte sammenfattet under skade, dog i en mindre effektiv måde. På jagt efter epikardielle aktivatorer er det altafgørende, at vi kan bestemme og sammenligne den fulde kapacitet af den føtale og voksne epicardium. Derudover fra et terapeutisk synspunkt er det vigtigt, at ud over dyreforsøg, vi udvide viden om reaktion af den menneskelige epicardium. Her, beskriver vi en metode til at isolere og kultur menneskelige voksen og fostrets epikardielle afledte celler (EPDCs) i en epitel-celle-lignende morfologi og fremkalde EMT. Med denne model, vi sigter mod at undersøge og sammenligne voksne og føtale epikardielle celle adfærd.

Den største fordel ved denne protokol er brug af menneskelige epikardielle materiale, som ikke er blevet grundigt undersøgt. Vigtigere, giver beskrevet isolation og celle kultur protokollen en enkelt ensartet metode til at udlede begge føtale og voksne cobble EPDCs, gør det muligt for en direkte sammenligning mellem disse to celle kilder. Derudover da epicardium er isoleret baseret på dens placering, er det sikret, at cellerne er faktisk epicardially afledte¹⁷.

Mens menneskelige EPDC isolation metoder har oprettet tidligere, regne disse for det meste udvækst protokoller hvor stykker af hjerte- eller epikardielle væv er belagt på en celle kultur parabol^18,19. Denne tilgang markerer dermed specielt til celler der delvist mister deres epitelial fænotype for at migrere, og der er mere tilbøjelige til at gennemgå spontan EMT. I den nuværende protokol behandles epicardium først i en enkelt celle løsning, som giver mulighed for de isolerede EPDCs til at opretholde deres epitelial tilstand. Denne metode giver derfor et solidt in vitro- model for at studere epikardielle EMT.