Analyser le comportement larves de drosophile en réponse à une Stimulation des neurones olfactifs Optogenetic
Summary
Ce protocole analyse le comportement de navigation de larve de drosophile en réponse à la stimulation simultanée d’optogenetic de ses neurones olfactifs. Lumière de longueur d’onde de 630 nm permet d’activer les neurones olfactifs individuels exprimant une rhodopsine canal décalée vers le rouge. Mouvement larvaire est suivi en même temps, d’enregistrement numérique et analysées à l’aide du logiciel d’écriture personnalisée.
Abstract
La capacité des insectes pour naviguer vers les sources d’odeurs est basée sur les activités de leurs neurones récepteurs olfactifs de premier ordre (ORN). Alors qu’une quantité considérable de renseignements s’est dégagée au sujet de l’ORN réponses aux substances odorantes, le rôle d’Orn spécifiques à la conduite des réponses comportementales reste mal compris. Des complications dans les analyses de comportement résultant de différentes volatilités des substances odorantes qui activent individuels Orn, Orn multiples activées par odorisants unique et la difficulté à reproduire les variations temporelles naturellement observées en utilisant des stimuli olfactifs méthodes conventionnelles odeur-livraison en laboratoire. Nous décrivons ici un protocole qui analyse le comportement larve de drosophile en réponse à la stimulation simultanée d’optogenetic de ses Orn. La technologie optogenetic utilisée ici permet pour la spécificité de l’activation de l’ORN et un contrôle précis des patterns temporels d’activation ORN. Mouvement de larve correspondant est l’objet d’un suivi, enregistrés numériquement et analysées à l’aide personnalisé écrit logiciel. En remplaçant des stimuli odeur par des stimuli lumineux, cette méthode permet un contrôle plus précis de l’activation de ORN individuel afin d’étudier son impact sur le comportement des larve. Notre méthode pourrait être étendu afin d’étudier l’impact des neurones de projection de second ordre (PNs) ainsi que les neurones les (LNs) sur le comportement des larve. Cette méthode permettra donc une dissection complète de fonction circuit olfactif et complément des études sur les activités de neurones olfactifs comment traduisent aux réponses de comportement.
Introduction
Les informations olfactives dans l’environnement d’une larve drosophile sont captées par seulement 21 Orn fonctionnellement distinctes, les activités dont finalement déterminer comportement larvaire1,2,3,4. Pourtant, relativement peu est connu sur la logique par laquelle l’information sensorielle est codée dans les activités de ces 21 Orn. Il est donc nécessaire de mesurer expérimentalement la contribution fonctionnelle de chaque larve ORN au comportement.
Bien que le profil de réponse sensorielle de tout le répertoire de Drosophila Orn larvaires a été étudié en détail1,4,5, les contributions d’Orn individuels pour le circuit olfactif et donc comportement de navigation demeurent largement inconnus. Jusqu’ici, des difficultés dans les études de comportement larvaire, surgir en raison de l’incapacité à spatialement et temporellement activer Orn unique. Un panel de substances odorantes qui activent spécifiquement les 19 de la 21 Orn de larves de drosophile a été récemment décrit1. Chaque substance odorante dans le panneau, à faible concentration, suscite une réaction physiologique qu’à partir de ses apparenté ORN. Cependant, des concentrations plus élevées qui sont normalement utilisés pour les essais de comportement conventionnel, chaque substance odorante suscite des réactions physiologiques de plusieurs Orn1,5,6. En outre, odorisants dans ce panneau ont varié de volatilités qui compliquent l’interprétation des études de comportement qui dépendent de la formation d’odeurs stable dégradés7,8. Enfin, naturellement, des stimuli naturels odeur ont une composante temporelle qui est difficile à reproduire en laboratoire. Il est donc important de développer une méthode permettant de mesurer les comportement larvaire tout en activant simultanément Orn individuels de façon spatiale et temporelle.
Ici, nous démontrons une méthode qui a des avantages par rapport aux décrite précédemment suivi larvaire dosages1,8. Le suivi décrit dans Gershow al repose sur des soupapes de commandés électronique pour maintenir un gradient stable d’odeur dans l’ arène de comportement8. Toutefois, en raison du niveau d’ingénierie complexe impliqué pour construire la configuration de stimulation d’odeur, cette méthode est difficile à reproduire dans d’autres laboratoires. En outre, les questions liées à l’utilisation des substances odorantes pour activer spécifiquement Orn unique demeurent irrésolues. Le test de suivi décrit dans Mathew et coll. utilise un système de livraison odeur plus simple, mais le gradient d’odeur qui en résulte dépend de la volatilité de la substance odorante test et est instable pour la longue durée de l’ essai1. Ainsi, en remplaçant des stimuli odeur par des stimuli lumineux, notre méthode a les avantages de la spécificité et un contrôle temporel précis d’activation ORN et n’est pas tributaire de la formation de gradients de l’odeur des différentes forces.
Notre méthode est facile à mettre en place et convient pour les chercheurs qui s’intéressent à la mesure des aspects de la navigation larve de drosophile . Cette technique pourrait être adaptée à d’autres systèmes de modèle pourvu que le chercheur est capable de conduire l’expression de CsChrimson dans neuron(s) de leur système préféré de choix. CsChrimson est une version décalée vers le rouge de la rhodopsine canal. Il est activé à longueurs d’onde qui sont invisibles au système phototaxie de la larve. Nous sommes donc en mesure de manipuler l’activité des neurones avec la spécificité, la fiabilité et la reproductibilité,9. En modifiant la coutume écrite logiciel pour tenir compte des modifications de la taille des sujets, cette méthode pourrait être facilement adaptée pour les larves d’autres espèces d’insectes rampants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode qui permet de mesurer le comportement larve de drosophile en réponse à l’activation simultanée d’optogenetic de neurones olfactifs. Décrit précédemment larvaire suivi des méthodes1,8 utilisent la technologie de livraison différentes odeurs pour activer Orn. Cependant, ces méthodes ne peuvent pas contrôler la spécificité ou les tendances temporelles de l’activation de ORN. Notre méthode permet de sur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l’Université du Nevada, Reno et par NIGM de l’Institut National de la santé sous le numéro de licence GM103650 P20.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
Referências
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
