Visualisering av cellulära elektrisk aktivitet i zebrafiskar tidiga embryon och tumörer
Summary
Här visar vi processen att skapa en cellulär elektrisk spänning reporter zebrafiskar linje för att visualisera embryonal utveckling, rörelse, och fisk tumör celler i vivo.
Abstract
Bioelectricity, endogena elektrisk signalering medieras av jonkanaler och pumpar ligger på cellmembranet, spelar viktiga roller i signalering processer av retbara neuronala och muskulös celler och många andra biologiska processer, såsom embryonala utvecklingsmässiga mallning. Dock finns det ett behov för i vivo elektrisk aktivitetsövervakning i ryggradsdjur embryogenes. Förskott av genetiskt kodade fluorescerande spänning indikatorer (GEVIs) har gjort det möjligt att tillhandahålla en lösning för denna utmaning. Här beskriver vi hur du skapar en transgena spänning indikator zebrafiskar använder den etablerade spänningsindikator, ASAP1 (Accelerated Sensor av handlingspänningar 1), som ett exempel. Tol2 kit och en allestädes närvarande zebrafiskar promotor, valdes ubi, i denna studie. Vi förklarar också processerna av Gateway platsspecifika kloning, Tol2 transposon-baserade zebrafiskar genmodifiering och avbildningsprocessen för tidigt skede fisk embryon och fisk tumörer med regelbundna epifluorescerande Mikroskop. Med denna fisk linje upptäckte vi att det finns cellulära elektrisk spänning förändringar under zebrafiskar embryogenes och fisk larval rörelse. Dessutom observerades det att tumören celler var allmänt polariserade i några zebrafiskar malign perifer nerv slida tumörer, jämfört de omgivande normala vävnaderna.
Introduction
Bioelectricity refererar till endogena elektrisk signalering medieras av jonkanaler och pumpar ligger på cellmembranet1. Joniska utbyte över den cellulära membranen, och de kopplade elektriska potentiella och nuvarande förändringarna, är väsentliga för signalering processer av retbara neuronala och muskulös celler. Bioelectricity och ion lutningar har dessutom en mängd andra viktiga biologiska funktioner inklusive energilagring, biosyntes och metaboliten transport. Bioelektriska signalering upptäcktes också som en regulator av embryonala mönster bildas, såsom kroppen yxor, cellcykeln och cell differentiering1. Det är således viktigt för att förstå många medfödda sjukdomar som följd av felaktig reglering av denna typ av signalering. Även om patch clamp har använts för att registrera enstaka celler, är det fortfarande långt ifrån idealisk för samtidig övervakning av flera celler under fosterutvecklingen i vivo. Dessutom är spänning känsliga små molekyler också inte idealisk för i vivo applikationer på grund av deras särdrag, känslighet och toxicitet.
Skapandet av en mängd genetiskt kodade fluorescerande spänning indikatorer (GEVIs) erbjuder en ny mekanism för att lösa detta problem, och möjliggör enkel applicering att studera embryonal utveckling, även om de ursprungligen var avsedda för övervakning av neurala celler2,3. En av de för närvarande tillgängliga GEVIs är accelererade Sensor av handlingspänningar 1 (ASAP1)4. Den består av en extracellulär loop av en spänningsavkännande domän spänning känsliga fosfatas och ett cirkulärt den omkastade grönt fluorescerande protein. Därför ASAP1 möjliggör visualisering av elektriska potentiella cellförändringar (polarisering: ljust grön; depolarisation: mörkgrön). ASAP1 har 2 ms on-och off kinetik och kan spåra subthreshold potentiella ändra4. Detta genetiska verktyg möjliggör således en ny nivå av effektivitet i realtidsövervakning av bioelektrisk i levande celler. Vidare förståelse av bioelectricity i embryonal utveckling och många sjukdomar, såsom cancer, roller kommer att kasta nytt ljus på de bakomliggande mekanismerna, som är avgörande för behandling och förebyggande.
Zebrafisk har visat en kraftfull djurmodell att studera utvecklingsbiologi och mänskliga sjukdomar inklusive cancer5,6. De delar 70% orthologous gener med människor, och de har liknande ryggradsdjur biologi7. Zebrafiskar ger relativt lättskött, en stor koppling storlek på ägg, fogligt genetik, lätt genmodifiering och transparent yttre embryonal utveckling, vilket gör dem ett överlägset system för in-vivo imaging5,6. Med stor strålningskälla mutant fisk redan finns och en fullt sekvenserat genomet ger zebrafiskar ett relativt obegränsat utbud av vetenskapliga upptäckter.
För att undersöka den i vivo realtid elektriska aktiviteten i cellerna, dra vi nytta av zebrafisk modellen systemet och ASAP1. I detta papper, vi beskriver hur att införliva den fluorescerande spänning biosensor ASAP1 i zebrafiskar genomet med Tol2 transposon genmodifiering, och visualisera cellulär elektriska aktivitet under fosterutvecklingen, fisk larval rörelse, och i levande tumör .
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om mobilnät och vävnaden nivå elektriska verksamhet under embryonal utveckling och mänsklig sjukdom upptäcktes för länge sedan, fortfarande i vivo dynamiska elektriska förändringarna och deras biologiska roller till stor del okända. En av de stora utmaningarna är att visualisera och kvantifiera de elektriska förändringarna. Patch clamp teknik är en break-through för att spåra enskilda celler, men dess tillämpning på ryggradsdjur embryon är begränsad eftersom de består av många celler….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det forskningsarbete som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health under Award nummer R35GM124913, Purdue University PI4D incitamentsprogram och PVM inre konkurrenskraftiga Grundläggande forskning medel Program. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis finansiering agenterna officiella åsikter. Vi tackar Koichi Kawakami för den Tol2 konstruktionen, Michael Lin för den ASAP1 konstruktionen, och Leonard Zon för ubi arrangören konstruera genom Addgene.
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
Referências
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
