포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 단일 체인 amphiphiles의 독특한 화학적 특성으로 인해 그 포함 diacylphospholipids에 비해 뚜렷한 속성을 전시 한다. 여기 우리는 준비, 정화, 그리고 이러한 amphiphiles의 전체 또는 일부 구성 리의 사용에 대 한 기술을 설명 합니다.
포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 전시 포함 diacylphospholipids 이러한 amphiphiles의 독특한 화학적 특성 때문에 비해 뚜렷한 속성. 특히, 지방산 리 단일 체인 amphiphiles의 상대적으로 높은 가용성 때문에, 동적 특성을 향상 시킵니다. 마찬가지로, 리 무료 지방산을 포함 하는 소금, divalent 양이온, carboxylic 산 머리 그룹 및 금속 이온 사이 강한 상호 작용 때문에 더 민감합니다. 여기 우리는 기술을 대 한 준비, 정화, 단일 체인 amphiphiles (예를 들어, 올레 산)의 전체 또는 일부 구성 리의 사용을 보여 줍니다.
리, 또는 소포-구획 이루어져 amphiphilic 지질 bilayer 막에 묶여-발견 사용 수많은 생명 의학 어플리케이션에 의약품, 세포 막의 모델 및 합성의 개발에 대 한 배달 차량으로 셀입니다. 우리와 다른 이른 생활에서 원시 세포 막의 모델로 리 채용도 했습니다. 1 , 2 , 3 , 4 일반적으로 이러한 시스템에서 우리는 고용 이러한 분자는 현대 셀 사용 하는 코딩 된 단백질 효소의 이점 없이 합성 하 간단 하 게 하나만 지질 탄화수소 꼬리 (예를 들면, 올레산)를 포함 하는 단일 체인 amphiphiles.
단일 체인 지질으로 구성 된 리는 diacylphospholipids에서 형성 된 것과 유사한 (예를 들어, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 또는 POPC) 그 경계 bilayer 막의 구성. 어느 클래스의 지질에서 형성 하는 리 녹아 페이로드를 유지할 수 있습니다 축소 고 다른 기술에 의해 순화 될 수 있습니다. 몇 가지 중요 한 차이점이 단일 체인 지질의 독특한 화학적 특성에서 유래한 다. 인지질에 의해 형성 된 소포는 넓은 pH 범위, 안정적인 지방산 소포는 약간 기본적인에 중립 pH (ca. 7-9), 기 준비를 위한 특정 pH 버퍼를 요구 하에서 안정만. 대부분의 시간,이 버퍼도 포함 될 수 있습니다 어느 기능 재료 (예를 들면, RNA)을 될 수 있는 소포 캡슐화에 대 한 특정 수용 성 분자 compartmentalized 생화학 반응 또는 간단한 형광 염료 (예를 들어, calcein에 대 한 ) 소포 특성에 대 한.
만 하나의 탄화수소 체인의 존재는 모두 더 침투성 용액에 더 동적 막을 생성 합니다. 또한, carboxylic 산 머리 그룹 (예를 들어, Mg2 +) 소금, divalent 양이온의 존재에 더 민감한 소포에 지방산 결과. 마그네슘 catalyzing protocells 생명의 기원 연구에 생 화 확 적인 반응에 대 한 가장 중요 한 divalent 양이온 중 하나입니다. 정교한 단백질 효소의 진화 이전 초기 생활에 RNA 지배적인 폴리머의 자기 복제 및 촉매 작용을 수행 하는 듀얼 기능으로 되었을 수도 있습니다. 마그네슘을 요구 하는 RNA에의 한 대표적인 예 관련 반응은 비 효소 RNA 복사, 1960 년대에 처음 시연 이다. 5 때 화학적으로 활성화 된 RNA 뉴클레오티드 (즉 2 methylimidazolide 뉴클레오티드) 기존 뇌관 템플릿 단지 바인딩할 뇌관의 3′-수 산 기 그룹 공격에 5′-인산 염 치환 하는 인접 한 활성화 된 단위체의 떠나는 그룹 (예: 2-methylimidazole), 및 양식 새로운 phosphodiester 본드. 이 RNA 복사 화학의 Mg2 +, 지방산 protocells와 호환 되려면 chelated 필요가 필요 합니다. 6 다른 Mg2 +-귀상어 ribozyme에 의해 촉매는 아마도 가장 특징이 촉매 RNA는 종속 반응. 두 개의 짧은 oligonucleotides에서 재구성 될 수 있다,이 ribozyme 젤 교대에 의해 모니터링 하는 데 편리한 자기 분열 반응을 수행 합니다. 이와 같이, 그것은 자주 생명의 기원 연구에 모델 ribozyme로 채택 된다. 7 unliganded 마그네슘에 대 한이 ribozyme에 의해 요구 사항으로 인해 리는 일반적으로 구성 지방산 및 글리세롤 지방산 에스테 르, 마그네슘을 더 안정는의 혼합물에 의해. 8 , 9 이 프로토콜에 선물이 기술을 우리가 준비, 조작, 이러한 vesicles의 특성에 대 한 개발 하 고 응용 프로그램의 이러한 vesicles protocells 호스트 비 효소 RNA 복사 및 귀상어 ribozyme 보여 촉매입니다.
리 지방산에서 형성 된 많은 원시 세포 그들의 높은 침투성 및 동적 속성에 대 한 잠재적인 모델 제안 있다. 단일 사슬 지방산의 carboxylic 머리 그룹만 자기 조립 막 제한 된 pH 범위에에 있으며 결과 막 소금의 존재에 매우 민감합니다. 그 결과, 지방산 소포 필요 다른 준비 및 인지질 소포와 비교 하는 메서드를 처리 합니다.
이 프로토콜에서 우리가 liposome 형성에 대 한 예를 들어 올레산을 사용 하지만 다른 긴 사슬 불포화 지방산 (C14) 및 그들의 유도체 (ca. myristoleic 산, palmitoleic 산과 해당 알콜 및 글리세롤 에스테 르) 소포 형성 총 지질 농도 cmc와 수 분 버퍼 pH는 박막 리하이드레이션 메서드를 다음 막 내에서 지방산의 pKa 가깝습니다. 이외의 tris HCl 버퍼가이 프로토콜에 사용, 붕 산 염 또는 인산 염 버퍼에서 형성 하는 소포는 일반적으로 매우 새13지방산 기 형성을 지원 하기 위해 다른 버퍼 시스템 (ca. bicine, 인산 염, 붕 산 염) 보도 했다. 재 후 결과 지방산 소포는 polydisperse 및 multilamellar, 하지만 쉽게 변환 됩니다 작은 단 분산 unilamellar 소포 밀어 남에 의해 설명 된 대로. 작은 소포를 생성 하기 위한 대체 방법으로 쥡니다와 비교, 압출 다른 기 공 크기 막 적용 하 여 소포 크기의 제어에 대 한 더 많은 옵션을 제공 합니다. 압출 후 소포는 보통 막 기 공 크기 보다 약간 더 큰 그러나 압출 사이클의 수를 늘림으로써, 소포 막 기 공 크기에 가까운 평균 크기와 좁은 크기 분포를 얻을 수 있다.
기능 protocells 합성, 지방산 소포 해야 호스트 특정 생화학 반응 RNA 또는 다른 빌딩 블록의 캡슐에 넣기에서 발생 합니다. 박막 리하이드레이션 메서드 원하는 캡슐화 된 물자를 포함 하는 양식 소포 하는 쉬운 방법을 제공 합니다. 그러나, 캡슐화 효율은 상대적으로 낮은 고 정화 과정에서 RNA 등 귀중 한 자료의 큰 부분 일반적으로 손실 됩니다. 경우에 따라 캡슐화 효율 겸손 압출 하기 전에 반복된 freeze-thaw 주기 하 여 개선할 수 있습니다. 그러나 유사한 방법 아직 지방산 소포에 대 한 개발 하지 않은 미세 메서드 인지질 리의 고수익 준비에 대 한 거의 100% 캡슐 효율성에 대 한 수 있습니다.
반응 속도의 정확도 영향을 미칠 수 있는 자료를 캡슐화 때 유출 protocells chelated 또는 무료 Mg2 +, 마그네슘 솔루션 추가 및 repurification 각 시간 포인트의 제거를 보장 하기 전에 후 정화 처리 소포 안에 측량입니다. 이후 각 정화 좋은 분리를 달성 기 분수를 수집 하 고 10 분 이상 걸립니다, 빠른 반응의 분석 어렵습니다, 그리고 반응 열 repurification 전에 중지 해야 합니다.
우리는 여기에 제시 하는 프로토콜은 원시 세포에서 발생할 수 있는 그를 흉내 낸 반응 호스트 지방산 리의 건설에 대 한 적합 합니다. 우리의 프로토콜 또한 생명 전달 시스템 및 다른 생 화 확 적인 반응에 대 한 생물 반응 기의 개발에 잠재적인 응용 프로그램 사용.
The authors have nothing to disclose.
J.W.S.은 하 워드 휴즈 의학 연구소의 조사. 이 작품은 J.W.S.에 시 몬스 재단에서 부여 (290363)에 의해 부분적으로 지원 A.E.E.와 K.P.A. 둘 다 미네소타의 대학 시작 자금 지원을 인정합니다.
sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |