Adaptation de 3' Amplification rapide des ADNc se termine pour mapper les transcriptions en Cancer

La formation de l’extrémité 3′ est une étape cruciale dans la maturation des ARNm qui comprend le clivage de l’ARN pré-messager en aval d’un PAS suivie par l’ajout de ~ 250 untemplated adénines, qui forment la queue poly (a)^1,2. La protéine de liaison de poly (a) (PABP) se lie à la queue poly (a), et cela protège la transcription de l’ARNm de la dégradation et facilite la traduction¹.

Les estimations actuelles suggèrent que 70 % des gènes humains ont plusieurs PASs et donc subir une alternative polyadénylation, entraînant plusieurs extrémités de 3′³. Ainsi, il est important d’identifier où la queue poly (a) s’adapte sur le reste de la région 3′ UTR, en plus d’identifier les FE utilisés par toute transcription donnée. L’avènement de la nouvelle génération de séquençage a entraîné l’identification simultanée de la 3′ UTR et le col de milliers de gènes. Cette augmentation de capacité de séquençage a nécessité le développement d’algorithmes bioinformatiques pour analyser les données impliquant la polyadénylation alternative de l’extrémité 3′. Pour la détection de novo ou la validation du PAS et par conséquent de cartographie de l’extrémité 3′ des gènes individuels de données de séquençage à grande échelle, 3′ RACE reste la méthode de choix^4,5. Les séquences incluses dans les produits de cDNA de 3′ course normalement n’incluent qu’une partie de la région 3′ UTR qui contient la queue poly (a), le site de clivage, le PAS et les séquences en amont du PAS. Contrairement à la PCR, qui requiert la conception et l’utilisation des amorces spécifiques et inverses de gène, 3′ RACE ne nécessite que deux gènes imbriqué avant des amorces spécifiques. Par conséquent, PCR requiert une connaissance plus détaillée de la séquence nucléotidique d’une grande région du gène étant amplifiés^4,6. Depuis 3′ RACE utilise le même inverser apprêt que cibles la poly (a) la queue pour les transcriptions polyadénylé RNA, seulement les amorces avant doivent être gène spécifique, ainsi, exigeant seulement la connaissance d’une région beaucoup plus petite de l’ARNm. Cela permet l’amplification des régions dont les séquences ne sont pas complètement caractérisé^4,7. Cela a permis à 3′ course permettant non seulement de déterminer l’extrémité 3′ d’un gène, mais également déterminer et caractériser les grandes régions en amont du PAS qui forment une partie importante de la région 3′ UTR. En combinant 5′ course avec la mis à jour le 3′ course qui comprend des portions plus importantes de la région 3′ UTR et régions adjacentes, on peut pleinement séquence ou cloner une toute transcription ARNm de l’extrémité 5′ à son extrémité de 3′⁸.

L’identification récente d’un roman CCND1-MRCK transcription de gène fusion de lignées de cellules de lymphome du manteau et de patients atteints de cancer en est un exemple de cette demande de mis à jour le 3′ RACE. La région 3′ UTR consistait en des séquences de gènes les CCND1 et MRCK et était récalcitrant à miRNA règlement⁹. Les deux imbriqués CCND1 avant des amorces spécifiques sont complémentaires dans la région immédiatement adjacente et en aval du codon CCND1 . Bien que le séquençage de transcriptome entier ainsi que des outils bioinformatiques spécifique peut être utilisé pour détecter des fusions de gènes au sein de la 3′ UTR¹⁰, nombreux laboratoires peuvent n’ont pas les ressources financières ou l’expertise de bioinformatique pour faire usage de cette technologie. 3′ RACE est donc une alternative pour l’identification de novo et la validation des gènes de roman fusion impliquant la région 3′ UTR. Considérant la drastique augmentation du nombre de gènes de fusion signalés ainsi que de lire par l’intermédiaire de transcriptions, 3′ RACE est devenu un outil puissant pour la caractérisation des séquences de gène^11,12. En outre, des études récentes ont montré que différentes séquences au sein de la région 3′ UTR ainsi que la longueur de la région 3′ UTR peut affecter mRNA stabilité de transcription, localisation, traduisibilité et fonction¹³. Due en partie à un intérêt accru dans la cartographie du transcriptome, il y a eu une augmentation du nombre des différents ADN polymérases, en cours d’élaboration pour une utilisation en laboratoire. Il est important de déterminer quels types de modifications peuvent être apportées à la 3′ Protocole de course en afin d’utiliser le répertoire disponible des ADN polymérases.

Ce travail rapports adaptation 3′ course de cartographier l’ensemble 3′ UTR, les FE et 3′ fin site de clivage de la transcription de ANKHD1 à l’aide d’imbriqués amorces au sein de la section ANKHD1 de la transcription et deux différents ADN polymérases.