Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

A formação da extremidade 3′ é um passo crítico na maturação do mRNA que compreende a clivagem do pre-mRNA a jusante de um PAS, seguido pela adição de 250 ~ untemplated adenines, que formam a cauda de poli^1,2. Proteína de ligação a poli (PABP) vincula-se à cauda poli (a), e isso protege a transcrição do mRNA de degradação e facilita a tradução¹.

As estimativas atuais sugerem que 70% dos genes humanos têm Passe múltiplo e, portanto, submeter-se poliadenilação alternativa, resultando em múltiplos 3′ extremidades³. Assim, é importante identificar onde a cauda poli (a) atribui ao resto do 3′ UTR, bem como identificar o PAS usado por qualquer transcrição determinada. O advento da próxima geração de sequenciamento resultou na identificação simultânea de 3′ UTRs e a passagem de milhares de genes. Este aumento na capacidade de sequenciamento exigiu o desenvolvimento de algoritmos de bioinformatic para analisar os dados envolvendo poliadenilação alternativa da extremidade 3′. Para a detecção de novo ou validação do PAS e, portanto, mapeamento da extremidade 3′ de genes individuais de dados de sequenciamento em larga escala, 3′ corrida continua a ser o método de escolha^4,5. As sequências incluídas em produtos de cDNA de 3′ corrida normalmente incluem apenas uma parte do 3′ UTR que contém a cauda poli (a), o local de clivagem, o PAS, sequências e o montante do PAS. Ao contrário do PCR, que requer a concepção e utilização do gene específico para diante e reverso primeiras demão, 3′ corrida requer apenas duas gene específico aninhado frente primeiras demão. Daí, a PCR requer um conhecimento mais detalhado da sequência de nucleotídeos de uma grande região do gene sendo amplificado^4,6. Desde 3′ corrida usa o mesmo inverter a primeira demão que metas a poli (a) cauda para todos polyadenylated RNA transcritos, somente os primers para a frente devem ser gene específico, assim, exigindo apenas conhecimento de uma região significativamente menor do mRNA. Isso permite que a amplificação das regiões cujas sequências não são inteiramente caracterizado^4,7. Isto permitiu 3′ corrida para ser usado não somente para determinar a extremidade 3′ de um gene, mas para também determinar e caracterizar regiões grandes montante do PAS que formam uma parcela significativa de 3′ UTR. Combinando 5′ corrida com o modificado 3′ corrida que inclui porções maiores de 3′ UTR e flanqueiam regiões, é possível totalmente sequenciar ou clonar uma transcrição de mRNA inteira da extremidade 5′ para seus 3′ final⁸.

Um exemplo desta aplicação de modificado 3′ corrida é a identificação recente de um romance CCND1-MRCK transcrição de gene de fusão de linhas de células do linfoma de células do manto e pacientes com câncer. O 3′ UTR consistia de sequências de genes de ambos os CCND1 e MRCK e foi recalcitrantes a miRNA Regulamento⁹. Os dois aninhados CCND1 específicos frente primers foram complementares à região imediatamente adjacente e a jusante do CCND1 códon de parada. Embora toda transcriptoma sequenciamento juntamente com ferramentas de bioinformatic específico pode ser usado para detectar fusões gene dentro do 3′ UTR¹⁰, muitos laboratórios podem não ter os recursos financeiros ou bioinformatic perícia para fazer uso desta tecnologia. Portanto, 3′ corrida é uma alternativa para novo de identificação e validação de genes de fusão novela envolvendo a 3′ UTR. Considerando o drástico aumento no número de genes de fusão relatados, bem como ler as transcrições, 3′ corrida tornou-se uma poderosa ferramenta na caracterização de gene sequências^11,12. Além disso, estudos recentes demonstraram que diferentes sequências dentro a 3′ UTR, bem como o comprimento de 3′ UTR pode afetar a estabilidade de transcrição do mRNA, localização, Traduzibilidade próprios e função¹³. Devido em parte ao crescente interesse no mapeamento da transcriptoma, tem havido um aumento no número de diferentes polimerases de DNA, sendo desenvolvido para uso em laboratório. É importante determinar que tipos de modificações podem ser feitos para o 3′ protocolo de corrida em a fim de utilizar o repertório disponível de polimerases de DNA.

Este trabalho de adaptação 3′ corrida para mapear o inteiro 3′ UTR de relatórios, o PAS e 3′ final local de clivagem da transcrição de ANKHD1 usando aninhados cartilhas dentro da seção de ANKHD1 de transcrição e dois diferentes polimerases de DNA.