Hızlı Nanoprobe sinyal geliştirme içinde in Situ altın nanoparçacık sentezi tarafından
Summary
Bu çalışmada, sinyal enhancement-in nanoprobe tabanlı biosensing için bir protokol sunulmuştur. Protokol chloroauric asit, altın, gümüş, Silis veya demir-oksit nano tanecikleri oluşan mevcut nano-sondalar yüzeyinin azaltılması temel alır.
Abstract
Nano-sondalar altın, gümüş, Silis veya algılama reaktifler bioanalytical deneyleri içinde olarak demir-oksit nano tanecikleri gibi kullanımı yüksek hassasiyet ve uygun Renkölçer okuma etkinleştirebilirsiniz. Ancak, nano tanecikleri yüksek yoğunlukları genel algılama için gereklidir. Mevcut geliştirme sentez tabanlı iletişim kuralları ya da altın ve gümüş için sınırlı nano tanecikleri ya da hassas enzimatik kontrol ve en iyi duruma getirme güveniyor. Burada, altın, gümüş, Silis ve demir oksit nano-sondalar Renkölçer okuma geliştirmek için bir protokol mevcut. Renkölçer sinyal tarafından kadar 10000-fold bir faktör geliştirilebilir ki gözlendi. Bu sinyal geliştirme stratejileri kimyasal azaltılması Au3 + Au0temelidir. Au3 + Au0azalma sağlamak çeşitli kimyasal reaksiyonlar vardır. İletişim kuralı ‘ iyi’nın arabellek ve H2O2 kullanılır ve Au0 varolan nano-sondalar, yeni altın nano tanecikleri oluşumu zararına olarak yüzeyinin birikimi lehine mümkündür. Chloroauric asit ve H2O2 ‘ 2-(N-morpholino) oluşan bir çözüm ile Mikroarray kuluçka, protokol oluşur nanoprobe tabanlı algılama tahlil takip ethanesulfonic asit pH 6 arabellek. Geliştirme çözüm kağıt ve cam tabanlı sensörler için uygulanabilir. Ayrıca, bu piyasada bulunan uzun bir ticari alerjene Mikroarray yöntemi uygulamaya tarafından gösterildiği gibi kullanılabilir. Sinyal geliştirme az 5 dk, kuluçka ve geliştirme çözüm gerektirir ve okuma çıplak gözle ya da masa üstü tarayıcı veya dijital kamera gibi düşük-uç görüntü edinme aygıtlar tarafından tespit edilebilir.
Introduction
Nanomalzemeler altın nano tanecikleri (AuNPs) veya demir oksit nano tanecikleri (IONPs) gibi kullanımı uygulamaları biosensing içinde geliştirilmiş hassasiyet ve çok yönlülüğü ile izin verdi. Nano tanecikleri ile hacim oranı için yüksek yüzeyini yararlanmak olarak çeşitli ligandlar ve yüzey dekorasyon için geliştirilen yöntemler bolluk etkin 1 sensörler tasarım geliştirilmiş hassasiyet ile. 2 yine de, bir biosensing aracı nano-sondalar algılanabilir sinyal elde etmek için gerekli sayısına bağlıdır. Örneğin, söz konusu olduğunda 40 nm AuNPs UV-VIS spektroskopisi, yaklaşık 90 × 106 nano-sondalar aracılığıyla bir sinyal elde etmek için etkin faiz hedefinin algılamak için gereklidir. 3 bu nanoprobe yoğunluğu sınırlama sinyal amplifikasyon kullanımı ile atlatılabilir. Böyle stratejileri4 interparticle toplama veya Aglomerasyon nerede ilk nano-sondalar yoğunluğu Nano-sondaları ilk üzerine ikinci bir dizi biriken tarafından artırılır, temel alabilir. 5 görsel veya UV-VIS sinyal Alım nano tanecikleri belirli bir yerde bir sensör yüzeyi sayısını arttırmak sağlar. Ancak, testin duyarlılığı nano tanecikleri nano-sondalar başlangıç kümesi doğru ikinci dizi hedefleme kapasiteli doğal olarak bağlanacaktır. Diğer stratejileri altın ve gümüş Nano sondaları boyama güveniyor. 6 , 7 boyama gümüş iyonları görsel veya UV-VIS algılama etkinleştirme nano tanecikleri yüzeyinin azaltılması yoluyla elde edilir. 8 bu yöntemler mevcut altın sinyal geliştirmek veya yüzey rezonans plasmon potentiating tarafından gümüş nano-sondalar, ikincil hedefleme olayları olduğu gibi interparticle Aglomerasyon yöntemleri bağlı değil sinyal. Ancak, gümüş boyama yöntemleri yalnızca altın veya gümüş nano-sondalar kullanımı ile bildirilmiştir. 8 , 9
2005 ‘ te Zayats ve ark. 10 Au iyonları yüzey plasmon rezonans sinyal artırmak için altın nano-sondalar yüzeyinin azaltılması bildirdi. Bu enzim bağımlı çalışmada, hidrojen peroksit chloroauric asit azalması izin cetyltrimethylammonium klorür birlikte ve glikoz oksidaz kataliz tarafından oluşturuldu.
Son zamanlarda Wang ve ark. altın bir katman nerede üretilen bir geliştirme yöntemi mevcut nano-sondalar yüzeyinde bildirdi. 11 genişlemiş bu nano-sondalar peroksidaz benzeri katalitik aktivitesi substrat 3 ‘, 5, 5 ‘-tetramethylbenzidine (TMB) parlak mavi renk görselleştirme çıplak gözle etkinleştirme karşı görüntülenir.
Stevens vd. Plazmonik ELISA tabanlı tahlil gelişimi bildirdi. 12 geleneksel ELISA stratejisi aracılığıyla Prostat spesifik antijen (PSA) algılama sonra katalaz ile etiketli bir ikincil antikor sonra sensör hidrojen peroksit içeren bir çözümde dalmış oldu sensör ile inkübe ve chloroauric asit. İkincil katalaz-modified antikor (olumlu sonuç) varlığı hidrojen peroksit, chloroauric asit azaltma yavaşlama ve yarı küresel monodispersed AuNPs kırmızı renk ile verimli tüketimi teşvik etmek. Katalaz-modified antikor (negatif sonuç) yokluğu böylece hızlı chloroauric azaltma teşvik ve AuNPs türleri, kötü tanımlanmış Morfoloji mavi/mor renk için sorumlu ile verimli olduğu gibi kalır için hidrojen peroksit konsantrasyon izin . Konsantrasyon hidrojen peroksit, katalaz, etkinlik tarafından belirlenen faiz analit konsantrasyon için ilişkili olduğu gösterildi. Katalaz-modified ikincil antikor ve katalitik aktivitesi şartları kontrolünü ihtiyacını bu yöntemin evrensellik engel iki etken vardır. Ayrıca, altın kümeleri, varolan AuNPs bağımsız oluşumu güçlendirme stratejisi için arka plan gürültü sorunları neden olabilir.
Yukarıda belirtilen teknikleri de birkaç diğerleri gibi13,14,15, bu mümkün kıldı nanoprobe tabanlı biyosensörler sınırları algılama geleneksel teknikleri ile eşit düzeyde ulaşmak için.
Burada, bir roman altın geliştirme yöntemi gösterilmiştir, nerede bir varolan nanoprobe sinyal güçlendirilmiş potentiating veya bir yüzey plasmon rezonans sinyal tanıtımı. Algılama altın, gümüş, Silis veya demir oksit nano tanecikleri kullanımı ile yapılır sonra sensör bir çözüm hidrojen peroksit ve 2-(N-Morpholino) chloroauric asit karışımı ile kuluçkaya yetkisi olan ethanesulfonic asit (MES) pH 6 arabellek. Geliştirme çözüm bileşenlerinde konsantrasyonları Au0 varolan nano-sondalar yüzeyinde birikimi iyilik için optimize. Tüm için nanoprobe türleri, i.eokudu. AuNPs, gümüş nano tanecikleri (AgNPs), Silis nano tanecikleri (SiNPs) ve IONPs, kötü tanımlanmış bir tabaka oluşumu vermiştir veya algılanabilir veya artan görünür bir sinyal sonuçlanan ışık saçılma artar. Nano-sondalar kağıt ve cam tabanlı microarrays için 100-fold büyütme faktörü bir sinyal artışı elde edildi ve işlemi bir sinyal almak için en az 5 dk sürer. Çıplak gözle, sinyal Alım yapılabilir UV-VIS spektroskopisi veya bir dijital fotoğraf makinesi veya bir masa üstü tarayıcı gibi düşük-uç araçları görüntüleme. Ayrıca, bu geliştirme Protokolü kolayca bir piyasada bulunan Anti teşhis tahlil özel optimizasyonu gerek kalmadan uygulanabilir olduğunu gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şu anda, sinyal geliştirme teknikleri nanoprobe tabanlı algılama ile deneyleri için her iki enzim tabanlı12, nano tanecikleri hedef algılama nano-sondalar21 için ikinci bir set gerektirir ya da teknikleri boyama durumunda için sınırlıdır AuNPs veya AgNPs algılama probları olarak kullanın. 22 burada, nanoprobe algılama tabanlı deneyleri sinyal geliştirme için basit, hızlı ve enzim ücretsiz yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntemle, nano-sondalar 4 türleri tarafından sağlanan Renkölçer sinyal artırmak mümkün: AuNPs, AgNPs, IONPs ve SiNPs.
Nano-sondalar kümelerine gözlenen amplifikasyon faktör, 100-fold, nerede miktar geliştirme faktörünün ön geliştirme sinyalleri eksikliği nedeniyle mümkün değildi SiNPs dışında oldu. Bu geliştirme faktör protokolünün etkinliği nano-sondalar tüm türleri arasında benzer olduğunu göstermektedir. Ayrıca, geliştirme Protokolü nerede bir hisse senedi AuNPs süspansiyon seyreltme dizi yazdırıldığı kağıt desteğinin üzerinde gerçekleştirildiği zaman 10000-fold büyütme faktörü gözlendi. Geliştirme, AuNPs numarası en düşük görünür lekeler için önceki nerede yaklaşık 10000 nano tanecikleri basıldı, geliştirme sonra az 10 nano tanecikleri yataklık noktalar görünür haline geldi vardı. 20
Burada sunulan geliştirme protokolü için kurulan koşulları azaltılması Au3 + sinyal arka plan gürültü minimuma koruyarak geliştirmek için Au0 yararlanarak sağladı. Şu tahlil için ilâ saklanan microarrays birkaç ay sonra tahlil gerçekleştirildi yanı sıra gerçekleştirildikten sonra geliştirme gerçekleştirilebilir. Geliştirme çözüm çözüm 1 ve çözüm 2 1:1 karışımından oluşur. Her iki çözüm de daha önce karışık veya doğrudan Mikroarray pipetted zaman karışık. Ön karıştırma veya doğrudan karıştırma arasındaki fark sadece raf ömrü geliştirme çözüm etkiler. Ne zaman öncesi karışık raf ömrü 5-7 gün 30-45 gün için değil artırma Pre karıştırılır.
Daha fazla çözümleme sonuçları geliştirme yöntemi Biyoalgılayıcı kantitatif analiz ile müdahale değil göstermiştir. Gözlenen yoğunluğu ve analit konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki (Tablo 1) devam edildi. Standart floresan algılama ve kolorimetrik algılama ile cam tabanlı alerjen bileşen Mikroarray immunoassay kullanma 4 önceden karakterize klinik örnekleri için elde edilen veriler iki algılama yöntemleri arasında iyi bir uyum gösterdi. Ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) ve ortalama Renkölçer yoğunluğu (MCI), bir ortalama R2 karşılaştırma = 0,08 +/-0,79 elde edilen verileri 10 günlük her iki eksen üzerinde olduğunda. Bu deney nano-sondalar için algılama kullanıyorsa veya nanoprobe tabanlı algılama için adapte edilebilir geliştirme yöntemi için ticari bir kit uygulanabilir gösterdi.
Geliştirme yöntemi etkinliği iki kritik yönü üzerinde dayanır. Bu çözüm 1 karışımı sağlamak önemlidir ve homojen 2 çözümüdür. Homojen bir karışım sensör çözüm 1 veya 2 diğer göre baskın nerede geliştirme çözüm kesirler ile temas halinde olacak. Bu Au3 + Au0böylece geliştirme verimliliğini zarar, azaltılması verimliliği azaltır. Kuluçka döneminde Mikroarray geliştirme çözüm temas ilgi tüm alanı önemlidir.
Bir sinyal vericiyi geliştirme elde etmek için geliştirme çözüm ile daha uzun bir kuluçka süre (yaklaşık 5 dk) gerekli olacaktır. Sinyal satın alma ile etkileyebilir arka plan gürültü gelişimi önlemek için Mikroarray yüzey (belirsiz birikimi hızlı bir altın Au0 ve bunun neticesi olan oluşumunu önlemek için önceden blokeörneğin BSA, PEG) olmalıdır katman.
Tahlil içsel etkinliğini geliştirme yöntemi için bir kısıtlamadır. Tahlil sinyal geliştirme gözlenen sağlamak için negatif ve pozitif denetimleri sahip gerçek pozitif sonuçlarına bağlanabilir gerektirir. Nano-sondalar bir non-spesifik etkileşim ile hedef ise, geliştirme geçerli olmayacaktır sonra sinyalleri satın aldı.
Diğer geliştirme teknikleri temel alınarak ya nanopartikül toplama veya geliştirilmiş sinyal Alım sağlar bir malzeme ile nano tanecikleri boyama. Nano tanecikleri algılama sitesinde sayısını toplanması teşvik ederek, sinyal Alım ya da görsel olarak mümkün olacaktır veya UV-VIS ölçümleri. 5 bu sinyal geliştirme teknikleri bir iki adım algılama sistemi, faiz ve nerede muhabir ilk algılama yapı bağlamak için gereken ikinci bir adım analit ilk tespiti güveniyor. Bu stratejileri evrensellik tahlil her türü için belirli geliştirme protokolü en iyi duruma getirme gereksinimi nedeniyle eksikliği.
Boyama, çok burada sunulan, protokolü gibi gümüş gibi boyama geliştirme teknikleri sinyal algılama yapıları, doğrudan geliştirme sağlar. Ancak, burada gösterilen protokolü farklı olarak, gümüş boyama sadece ya AuNPs ya da AgNPs uygulanmak üzere gösterilmiştir. 6 , 7 , 8 , 9
Bu yöntem uygulanabilirliği büyük olasılıkla AuNPs, AgNPs, IONPs veya SiNPs algılama aracıları kullanan herhangi bir tahlil yayılan. Diğer malzemelerden oluşan sensörler yönteminde uygulanması çalışmaya daha fazla çalışma yürütülmektedir.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği’nin yedinci çerçeve programı (FP/2007-2013) altında finansman / ERC hibe sözleşmesi No 615458, İsveçli Araştırma Konseyi ve Pronova mükemmellik merkezi için protein teknolojisi (VINNOVA – İsveç Hükümet ajansı yenilik sistemleri için) minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
Referências
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
