JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

Быстрый Nanoprobe сигнала повышение синтеза наночастиц золота в Situ

Published: March 07, 2018
doi:
10.3791/57297
, , , ,
1Division of Proteomics and Nanobiotechnology, Science for Life Laboratory,KTH Royal Institute of Technology, 2Global Research and Development,Thermo Fisher Scientific IDD

Summary

В этой работе представлен протокол для повышения сигнал на основе nanoprobe biosensing. Протокол основан на сокращение Тетрахлороауратовая кислоты на поверхность существующих nanoprobes, которые состоят из золота, серебра, кремнезема или наночастиц оксида железа.

Abstract

Использование nanoprobes таких, как золото, серебро, кремний или наночастиц оксида железа как обнаружения реагенты в Биоаналитические анализов можно включить высокой чувствительностью и удобный колориметрические индикация. Однако высокая плотность наночастиц обычно необходимы для обнаружения. Доступные на основе синтеза повышение протоколы являются либо ограничивается золотых и серебряных наночастиц или полагаться на точные ферментативные управления и оптимизации. Здесь мы представляем протокол для повышения колориметрические индикация золота, серебра, кремния и железа оксид nanoprobes. Было отмечено, что колориметрические сигнал может быть улучшена путем до кратного фактор. Основой для таких стратегий повышения сигнала является химическое сокращение АС3 + АС0. Есть несколько химических реакций, которые позволяют сокращение АС3 + АС0. В протоколе используются буферы и H2O2 товара и возможно к осаждению0 Au на поверхность существующих nanoprobes, в ущерб формирования новой наночастиц золота. Протокол состоит из инкубации microarray с раствор, состоящий из Тетрахлороауратовая кислоты и H2O2 в 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic буфер рН 6 после обнаружения на основе nanoprobe анализа. Повышение решение может применяться к бумаге и датчики на стеклянной основе. Кроме того она может использоваться в коммерчески доступных immunoassays, как продемонстрировано применение метода для коммерческих аллергенов microarray. Сигнал для развития требуется менее чем за 5 минут инкубации с решением повышение и индикация может оцениваться невооруженным глазом или приобретения устройства low-end изображения настольного сканера или цифровой камеры.

Introduction

Использование наноматериалов наночастиц золота (AuNPs) или наночастиц оксида железа (IONPs) позволило приложений в biosensing с улучшена чувствительность и гибкость. 1 множество методов, разработанных для отделки поверхности наночастиц с различных лигандов, чтобы воспользоваться их высокой поверхности соотношение объема, позволили дизайн датчиков с улучшена чувствительность. 2 тем не менее, средство biosensing зависит от числа nanoprobes, необходимых для достижения обнаруженный сигнал. Например, в случае 40 Нм AuNPs, чтобы получить сигнал через спектроскопия UV-vis, примерно 90 × 106 nanoprobes необходим для того, чтобы эффективно обнаруживать цели интерес. 3 это nanoprobe плотность ограничение можно обойти с помощью усиления сигнала. Такие стратегии4 могут быть основаны на interparticle агрегации или агломерации, где плотность начального nanoprobes увеличивается, накапливая второй набор nanoprobes после первого. 5 увеличение количества наночастиц в данном месте на поверхности датчика позволяет visual или UV-vis сигнала приобретения. Однако чувствительность assay будет неразрывно связано с возможности таргетинга второго набора наночастиц к первоначальный набор nanoprobes. Другие стратегии полагаются на окрашивание или золота и серебра nanoprobes. 6 , 7 окрашивание достигается путем сокращения ионов серебра на поверхности наночастиц, позволяя visual или UV-vis обнаружения. 8 эти методы повышения сигнал существующих золотые или серебряные nanoprobes, потенцирования поверхности резонанс плазмон сигнал, не в зависимости от среднего ориентации событий как методы interparticle агломерации. Однако Серебряные пятная методы только были зарегистрированы с использованием золота или серебра nanoprobes. 8 , 9

В 2005 году заяц и др. 10 сообщили о сокращении Au ионов на поверхность золота nanoprobes для увеличения сигнала поверхностного плазмон резонанс. В этой работе фермента зависимых перекись водорода был сгенерирован глюкоза оксидаза катализа и вместе с cetyltrimethylammonium хлорид, позволило уменьшить Тетрахлороауратовая кислоты.

Совсем недавно Ван и др. сообщил метод повышения, где производится золотой слой на поверхности существующих nanoprobes. 11 эти увеличенные nanoprobes отображается каталитическую активность пероксидазы как против субстрат 3 ‘, 5, 5 ‘ тетраметилбензидина (ТМБ) включение визуализации ярко-синий цвет невооруженным глазом.

Согласно Stevens et al. сообщила о разработке плазмонных анализа ELISA-основе. 12 после обнаружения простат специфический антиген (PSA) через традиционные стратегии ELISA, вторичное антитело обозначено с каталазой был инкубировали с датчиком, после чего датчик был погружен в раствор, содержащий перекись водорода и Тетрахлороауратовая кислота. Присутствие вторичного каталаза модифицированные антитела (позитивный результат) будет способствовать потребление перекиси водорода, замедление Тетрахлороауратовая кислота сокращения и приносит квази сферических монодисперсными AuNPs с красным цветом. Отсутствие изменения каталазы антитела (отрицательный результат) допустимая концентрация перекиси водорода остаются нетронутыми, содействуя тем самым сокращению быстрого Тетрахлороауратовая и приносит AuNPs с нечетко морфологии ответственных за голубой/пурпурный цвет . Концентрация перекиси водорода, определяется активности каталазы, показали корреляцию концентрации аналита интерес. Необходимость каталаза модифицированные вторичные антитела и контроля условий каталитической активности являются двумя факторами, которые препятствуют универсальность данного метода. Кроме того формирования золота кластеров, независимо от существующих AuNPs, может представить стратегии усиления фонового шума проблемы.

Вышеупомянутые методы, как также несколько других13,14,15, сделали возможным для биосенсоры на основе nanoprobe для достижения пределов обнаружения наравне с традиционными методами.

Здесь, метод Роман золото повышения показали, где сигнал существующих nanoprobe усиливается потенцирования или введения поверхностного плазмон резонанс сигнал. После обнаружения осуществляется с использованием золота, серебра, кремнезема или наночастиц оксида железа, датчик разрешено инкубировать раствором смеси водорода пероксида и кислоты Тетрахлороауратовая в 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислоты (MES) рН 6 буфера. Концентрации компонентов в решении повышение были оптимизированы для осаждению0 Au на поверхности существующих nanoprobes. Для всех изучал nanoprobe типа, т.е. AuNPs, наночастиц серебра (AgNPs), кремния наночастиц (SiNPs) и IONPs, формирование нечетко слоя принесли или Расширенная рассеяния света, что привело к обнаружению или увеличение видимый сигнал. Было обеспечено увеличение сигнала с 100-кратного коэффициент усиления для nanoprobes бумаги и стекла основе microarrays и процесс занимает менее 5 минут получить сигнал. Приобретение сигнала может быть сделано путем невооруженным глазом, спектроскопия UV-vis или изображений low-end инструменты например, цифровой камеры или сканера столешницы. Кроме того было продемонстрировано, что это расширение протокола может легко применяться в коммерчески доступные специальные диагностические пробы без необходимости конкретных оптимизации.

Protocol

В соответствии с правовыми и этическими требованиями страны коллекции, т.е.были получены образцы сыворотки крови человека. с одобрения Комитета по этике (или аналогичные) и с письменного согласия донора. 1. совершенствование приготовления раствора: Подготовьте буфер рН 6 мес 10 мм, приостановив MES натриевой соли в деионизированной воде. Отрегулируйте пэ-аш до 6 с использованием раствора NaOH 4 М. Подготовьте 5 мм HAuCl4 раствора в 10 мм MES рН 6 буфера (решение 1). Подготовьте 1.027 М H2O2 раствора в 10 мм MES рН 6 буфера (решение 2).Примечание: Объемы решения 1 и 2 решения зависит от количества и размера microarrays необходимо укрепить. Например microarray 10 x 10 мм требует 100 мкл общий объем (раствор 1 + решение 2) для обеспечения области microarray контакте повышение решения. После разбавления H2O2 следует использовать в течение примерно 30-45 дней. 2. наночастицы подготовка: Подготовить 40 Нм AuNPs как описано в Bastús и др. 16 кратко, придать 1 мл водного 25 мм HAuCl4 прекурсоров в кипящий Раствор цитрата натрия 2,2 мм (149 мл). Подождите, пока наблюдается цвета красного вина. Используйте это решение наночастиц как семена для семян рост шаги. На 90 ° C придать 1 мл цитрата натрия 60 мм, следуют 1 мл 25 мм HAuCl4 в семена, содержащие решения. После 30 мин реакция будет завершена. Повторите шаг семян рост пять раз получаются 40 Нм наночастиц, как описано в Bastús и др. 16 Измерьте absorbance UV-vis окончательного решения наночастиц для определения размеров наночастиц. 17 в качестве альтернативы, передачи электронной микроскопии (ТЕА) может быть приобрел и используется для определения размера наночастиц. Подготовить 90 Нм AgNPs как описано в Риверо и др. 18 кратко, добавить dimethylaminoborane (DMAB) энергично перемешивают раствор поли (акриловая кислота, натриевая соль) (ПАА) и AgNO3. Окончательный объем раствора-50 мл и конечная концентрация DMAB, ПАА и AgNO3 1,6 мм, 10 мм и 3.33 мм, соответственно.Примечание: 100 Нм IONPs карбоксильных групп и 50 Нм, SiNPs, модифицированные с карбоксильных групп были приобретены. Functionalize AuNPs с антителами после Протокол описан Puertas и др. 19 кратко, добавить 1 мг СООН-PEG-SH (5000 г•моль−1) решения 1.2×10-9 M AuNPs (10 оптической плотности, OD). Отрегулируйте пэ-аш до 12 с раствором 4 M NaOH. Пусть решение инкубировать на ночь, при комнатной температуре (~ 22 ° C), мягкий перемешивания условиях. Удалите избыток PEG центрифугированием решение в 13800 x g за 15 мин. Ресуспензируйте лепешка с 500 мкл деионизованной воды. Инкубировать PEG-модифицированных AuNPs с 5 мкмоль N-(3-Dimethylaminopropyl)-n ‘-ethylcarbodiimide гидрохлорид (EDC) и 7,5 мкмоль N-hydroxysulfosuccinimide натриевая соль (сульфогруппу NHS) в 10 мм MES pH 6 буфера для 30 минут при 37 ° C. Удалите избыток EDC и сульфогруппу NHS центрифугированием решение в 13800 x g за 5 мин. Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл буфера рН 6 мес 10 мм и добавьте 100 g·mL-1 антител. Пусть решение Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C. Удалите избыток антитела центрифугированием решение в 13800 x g 10 минут дважды и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл 10 мм натрия фосфат рН 7,5, 0,3 М NaCl буфера. Пусть решение Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C. Удалите неспецифических привязанного антитела центрифугированием решение в 13800 x g 10 минут дважды и Ресуспензируйте Пелле в 500 мкл 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в буфер рН 6 мес 10 мм. Проинкубируйте образцы на 4 ° C на ночь. Вымойте избыток BSA путем центрифугирования решение в 13800 x g 10 минут дважды и resuspending гранулы в 500 мкл буфера рН 6 мес 10 мм. Следуйте инструкциям 2.5.1 через 2.5.9 для модификации AgNPs 5 М, 0,5 мг IONPS и 0,5 мг SiNPs с антителами, регулируя количество EDC и сульфогруппу NHS соответственно. 3. вертикальный поток-на бумажной основе анализов: Подготовьте microarrays сдав градиента концентрации протеина G на нитроцеллюлозную мембрану бумаги с роботизированной принтера. После печати, пусть microarrays высушивается на ночь при комнатной температуре (~ 22 ° C). Осуществлять вертикальный поток пробы с мембраной, заключенный в держатель фильтра. Потока 8 M раствор AuNPs IgG модифицированные с помощью ультра шприцевой насос в размере 1 mL·min−1. Повторите этот шаг с раствором 17 M IgG-модифицированных AgNPs, 0.1 mg·mL−1 IgG модифицированных SiNPs и 0,1 mg·mL−1 IgG модифицированных IONPs. Пусть microarrays высохнуть при комнатной температуре (~ 22 ° C) в течение 30 мин и сканировать их в планшетный сканер с разрешением 4800 точек на дюйм. Изображения можно сохраните как файлы TIFF 24-битный цвет. 4. справочник коммерческих на стеклянной основе анализов: Инкубируйте два стекла предметные для 120 мин для обнаружения компонентов аллергена с 4 различных человеческих образцов при комнатной температуре. Промойте microarrays деионизированной водой. Инкубировать один слайд с конъюгированных люминесцентные античеловеческие IgE антител при комнатной температуре (~ 22 ° C) для 30 min. инкубировать второго слайда с антинародным IgE антител модифицированных AuNPs за 30 мин при комнатной температуре. Промойте microarrays деионизированной водой. Измеряют интенсивность флуоресценции microarray дна, который был инкубировали с флуоресцентные антитела IgE борьбе человека с лазерного сканирования аппарат. Оцифровывать microarray дна, который был инкубировали с антинародным IgE антител модифицированных AuNPs столешница сканера для приобретения колориметрические сигнала. После оцифровки Инкубируйте microarray раствором повышение при комнатной температуре (~ 22° C) в течение 5 мин. Промойте датчик деионизированной водой и дайте ему высохнуть в течение 10 минут при комнатной температуре (~ 22 ° C). Оцифровывать microarray с столешница сканер с разрешением 4800 точек на дюйм для приобретения колориметрические сигнала. Сохраните изображения как 16-битные оттенки серого файлы TIFF. 5. Microarray инкубации с повышение решения: Предварительно смешать такое же количество раствора 1 и 2 решения или смешивать их непосредственно на поверхности датчика и убедитесь, что область интереса на microarray дна покрыта смесь раствора. Пусть датчик инкубации при комнатной температуре с решением повышение для вверх на 5 минут дольше инкубации время могут принести улучшения чувствительности, а также выше соотношение сигнал/шум, особенно для бумажных microarrays. Вымойте microarray дна, погрузив его в деионизированной воде один раз для 5 s. оставить сушить при комнатной температуре.Примечание: Время сушки шаг зависит от материала microarray. Для бумажных microarray дна сушки шаг требует около 30 мин. Для стекла на основе microarray дна сушки шаг требует приблизительно 5-10 мин. 6. изображений анализ: Анализируйте интенсивностью флюоресценции с программное средство. Рассмотрим все результаты, которые равны или больше, чем 0.3 Isac стандартизировать единиц (ГИП), после направления использования (DfU) датчик Производитель. Анализируйте колориметрические интенсивности, с помощью программного средства. Инвертировать файлы изображений, измерить интенсивность каждого пятна и рассчитать интенсивность средняя пикселей. Используйте значения трех экземплярах пятна для вычисления значения окончательный сигнал как среднее трех среднее место пиксель света.

Representative Results

После того, как assay осуществляется, используя nanoprobes в качестве обнаружения агентов, области обнаружения датчика может заполняться с nanoprobes(рисунок 1). Если количество nanoprobes ниже предела для визуального обнаружения, выявления аналита первоначально, считается отрицательным. С помощью протокола, представленные здесь (рис. 1б), сигнал nanoprobes потенцированные путем введения нечетко слой Au (рис. 1c). Бумажной иммуноанализ, предназначенных для обнаружения протеина G был проведен чтобы продемонстрировать эффективность укрепления Протокола (рис. 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs и IONPs были изменены с IgG антитела и используется и обнаружения агентов. Бумага microarrays были подготовлены а градиент целого ряда молекул протеина G на месте. После того, как была проведена assay, было отмечено, что IgG, модифицированных AuNPs (IgG-AuNPs) смогли обнаружить как низко как 2 × 105 молекул в пятно(рисунок 2), IgG, модифицированных AgNPs (IgG-AgNPs) смогли обнаружить как низко как 2 × 10-4 молекулы на место (рис. 2c), IgG изменение IONPs (IgG-IONPs) смогли обнаружить как низко как 2 × 107 молекул на место (рис. 2e) и изменение IgG SiNPs (IgG-SiNPs) не смогли обеспечить визуальный сигнал ( Рисунок 2g). Инкубации microarrays раствором повышение, стало возможным увеличить сигнал по 100 раз для всех типов использования наночастиц. В случае SiNPs, повышение решение стало возможным соблюдать сигнала, где визуальный сигнал не наблюдалась без повышения решения (рис. 2b, 2d, 2f и 2 h). Возможность применения метода для существующих коммерческих иммуноферментных была оценена. Повышение была проведена на стеклянной основе Аллерген компонент microarray иммуноанализа. Набор из 4 проверяются и характеризуется сыворотки, образцы от аллергических пациентов были оценены с microarray (образцы были обозначены как а, b, c и d). Стандартный флуориметрический обнаружения этот assay был по сравнению с окрашивание с анти МГЭ помечены AuNPs следуют повышение сигнала (рис. 3). До расширения не пятна были обнаружены на microarrays, где обнаружение осуществлялась с анти МГЭ помечены AuNPs. После повышения несколько пятна были видны невооруженным глазом и интенсивности их был зарегистрирован оцифровки изображения (рис. 3). С флуоресцентным обнаружением, различные пятна были обнаружены (рис. 3). Рисунок 1 . Иллюстрация шагов точки проходит от обнаружения исследуемое вещество для повышения сигнал. () два антитела модифицированных nanoprobes после обнаружения аналита иммобилизованных на точки, (b) инкубации microarray с протоколом повышение и последующих семян рост антитела модифицированных nanoprobes и () c) точки, где размер nanoprobes увеличилось после инкубации 5 мин с решением повышение. Эта цифра была dapted от Диас и др. 20 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 . Оцифрованных изображений microarrays для обнаружения белка г. В левой части каждого microarray являются наблюдаемые точек до повышение осуществляется с () IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) выявление IgG-IONPs и (g) IgG-SiNPs. В правой части каждой microarray являются точек после расширения (б) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs и (h) IgG-SiNPs. Каждый концентрацию протеина G был сдан на microarray в трех экземплярах. Расчет количества белка, что G было сделано на основе концентрации белка напечатаны на каждой точки. Эта цифра была адаптирована из Диас и др. 20 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 . Корреляция между интенсивности флуоресценции и колориметрические интенсивности, полученные для анализов осуществляется с коммерческих специальные диагностические assay. Означают интенсивности флуоресценции (MFI) и означает колориметрические интенсивности (MCI) измеряется для выявления аллергенов в образцах a, b, c и d. вставки являются данные журнала 10 превращается в интервалы, где наблюдалась линейная корреляция между обоими методами. Интенсивность точек, наблюдается для обнаружения на основе модифицированного Флюорофор антител (Флюорофор-Ab) является флуоресценции выбросов. Яркость точек, наблюдается для обнаружения, основанный на АБ-AuNPs assay был получен после оцифровки microarray и переворачивать изображение с визуализации программного обеспечения. Microarrays предназначены чтобы вертикальные triplicates с позитивные элементы управления для флуоресценции обнаружения на дне ультраправых. Три других углов используются для оценки программного обеспечения. Изображения были проанализированы в 16-битные оттенки серого. Эта цифра была адаптирована из Диас и др. 20 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. R2 предварительное расширение R2 после повышения IgG-AuNPs 8.70E-01 7.80E-01 IgG-AgNPs 9.10E-01 9.60E-01 IgG-IONPs 9.17E-01 9.30E-01 IgG-SiNPs – 8.50E-01 Таблицы 1. R2 значения для обнаружения протеина G, до и после расширения, используя различные наборы наночастиц. R2 значения были получены после того, как корреляция интенсивности пятна с концентрации аналита измеряется.

Discussion

В настоящее время методов повышения сигнала для анализов с обнаружения на основе nanoprobe являются либо на основе ферментов12, требуют второй набор наночастиц для целевого обнаружения nanoprobes21 или, в случае пятная методы, ограничены Использование AuNPs или AgNPs как датчики обнаружения. 22 здесь, простой, быстрый и фермента описан метод для повышения сигнал nanoprobe на основе обнаружения анализов. С помощью этого метода, удалось повысить колориметрические сигнала, предоставляемые 4 вида nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs и SiNPs.

Наблюдается усиление фактор для каждого набора nanoprobes был в 100 раз, за исключением SiNPs, где количественной оценки повышения коэффициента не было возможным из-за отсутствия предварительной повышение сигналов. Этот фактор повышения свидетельствует о том, что эффективность протокола аналогичен для всех типов nanoprobes. Кроме того когда расширение протокола осуществлялась на опоре для бумаги, где была напечатана разрежения серии акций AuNPs подвеска, было отмечено кратного коэфф. Предыдущее повышение, видимых пятен с наименьшее количество AuNPs были, где были напечатаны около 10000 наночастиц, после повышения пятна, укрывательство менее 10 наночастиц стали видны. 20

Условий, установленных для укрепления Протокола, здесь представлены позволили воспользоваться сокращения АС3 + 0 Au для улучшения сигнала, при сохранении фонового шума до минимума. Повышение может выполняться сразу после генотипирования также, как на microarrays, которые были сохранены для до нескольких месяцев после assay была выполнена. Повышение решение состоит из смеси 1:1 1 и 2. Оба решения может быть ранее смешанные или непосредственно смешанные, когда накапаны на microarray. Разница между предварительного смешивания или прямого смешивания затрагивает только годности расширение решения. Когда предварительно смешанные, срок 5-7 дней, увеличение до 30-45 дней, если не предварительно смешивают.

Дальнейший анализ результатов показал, что метод повышения не вмешиваться с количественного анализа биодатчик. Линейной корреляции между интенсивностью наблюдается и концентрации аналита сохранялся (Таблица 1). Данные, полученные для 4 предварительно выявленных клинических образцов, с помощью иммуноферментного анализа компонента microarray дна на стеклянной основе аллерген, со стандартным флуоресценции обнаружения и колориметрические, показал хорошее согласование между двумя методами обнаружения. Сравнивая среднее флуоресценции интенсивности (MFI) и среднее колориметрический (MCI), в среднем R2 = 0,79 +/-0,08 был получен, когда данные 10-вход по обеим осям. Этот эксперимент показал, что метод повышения может применяться для коммерческих комплект, если он использует nanoprobes для обнаружения или могут быть приспособлены для обнаружения на основе nanoprobe.

Повышение эффективности метода основывается на двух важных аспектах. Важно гарантировать, что смесь раствора 1 и решением 2 является однородной. Без однородная смесь датчик будет соприкасаться фракций повышение решения где решение 1 или 2 преобладает относительно другого. Это уменьшит эффективность сокращения АС3 + АС0, таким образом ущерб эффективности укрепления. Важно также иметь всю область интереса microarray контакте повышение решения во время инкубационного периода.

Для достижения сверхчувствительная повышение сигнала, потребуется больше время инкубации (примерно 5 минут) с решением повышение. Чтобы избежать развития фоновый шум, что может помешать с приемом сигнала, microarray поверхность должна быть ранее заблокированных (например BSA, PEG) для предотвращения быстрого неспецифических осаждения0 и последующего формирования Au золота слой.

Ограничение в метод расширения является внутренняя эффективность анализа. Assay требует, имеющих негативные и позитивные элементы управления обеспечивать, что наблюдается повышение сигнала можно объяснить значение true положительные результаты. Если есть неспецифичные взаимодействия nanoprobes с целью, сигналы приобрел после того, как повышение не будет действительным.

Другие методы повышения основе либо наночастиц агрегации или окрашивание наночастиц с материалом, который позволяет улучшенная сигнала приобретения. Путем содействия сбору количество наночастиц на месте обнаружения, приобретение сигнала можно будет либо визуально или измерения UV-Vis. 5 эти методы повышения сигнал полагаться на системы обнаружения двухступенчатый, первоначального обнаружения аналита интерес и второй шаг, когда репортер требуется для привязки к конструкции первоначального обнаружения. Такие стратегии не хватает универсальности благодаря требование о конкретных расширение протокола оптимизации для каждого типа анализа.

Окрашивание улучшение методов, таких как серебро, окрашивание, гораздо как и протокол здесь представлены, позволяют прямой укрепление конструкций обнаружения сигнала. Однако в отличие от протокола, показанный здесь, Серебряные пятная только было показано применяться к AuNPs или AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9

Применимость данного метода может вероятно охватывают любой assay, который использует AuNPs, AgNPs, IONPs или SiNPs как обнаружения агентов. Дальнейшая работа осуществляется изучение применения метода в датчики, состоящий из других материалов.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Финансирование от Европейского Совета исследований под седьмой рамочной программы Европейского союза (FP/2007-2013) / центр КЧП Грант соглашение № 615458, Шведский научно-исследовательский совет и Pronova передового опыта для белка технологии (ВИННОВА – шведский Правительственные агентства для инновационных систем) с благодарностью.

Materials

Chloroauric acid Sigma-Aldrich 254169 ALDRICH
Sodium citrate Sigma-Aldrich S4641 SIGMA-ALDRICH
Dimethylaminoborane  Sigma-Aldrich 476668 ALDRICH
Poly(acrylic acid, sodium salt)  Sigma-Aldrich 416037 ALDRICH
Silver nitrate Sigma-Aldrich 204390 ALDRICH
100 nm magnetic nanoparticles Ademtech 021111
50 nm silica nanoparticles Corposcular 140510-10
COOH-PEG-SH  RAPP Polymere 135000-4-32
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.06462 EMD MILLIPORE
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 SIGMA
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt  Sigma-Aldrich 56485 ALDRICH
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 95313 SIGMA-ALDRICH
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma-Aldrich M8250 SIGMA
IgG antibody Abcam
Sodium phosphate  Sigma-Aldrich 342483 ALDRICH
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Bovine serum albumin VWR  422351S
Protein G Thermo Scientific 21193
Nitrocellulose paper membrane Whatman 10402096
Nanoplotter 2.1 robotic printer GeSIM
Filter holder Merck XX3001200
PhD2000 Ultrasyring pump Harvard
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II Cannon
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs  Thermofisher
Laser scanning LuxScan 10/K Capital Bio
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro Epson
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 Thermofisher 81-1011-01
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody  Thermofisher 81-1011-01
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4  Thermofisher
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
  2. Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
  3. Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
  4. Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
  5. Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
  6. Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
  7. Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
  8. Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
  9. Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
  10. Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
  11. Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
  12. de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
  13. Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
  14. Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
  15. Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
  16. Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  17. Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
  18. Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
  19. Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
  20. Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
  21. Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
  22. Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).

Tags

NanoparticleGold NanoparticleSignal EnhancementColorimetricPaperGlassMES BufferPEGEDCSulfo-NHSIgG AntibodySodium PhosphateSodium ChlorideBSA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis. J. Vis. Exp. (133), e57297, doi:10.3791/57297 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image