原位金纳米粒子合成快速 Nanoprobe 信号增强

根据收集国的法律和伦理要求, 获得了人体血清样本, i. e。经过伦理委员会 (或类似) 的批准, 并得到捐助者的书面同意。 1. 增强解决方案准备: 在去离子水中悬浮 mes 钠盐, 制备10毫米 mes pH 6 缓冲液。使用4米氢氧化钠溶液将 pH 值调整为6。 在10毫米 MES pH 值6缓冲器 (解决方案 1) 中准备一个 5 mm HAuCl4解决方案。 在10毫米 MES pH 值6缓冲区 (解决方案 2) 中准备一个1.027 米 H2O2解决方案。注意: 两个解决方案1和解决方案2的卷取决于要增强的微阵列的数量和大小。例如, 10 x 10 毫米的微阵列需要 100 ul 总容量 (解决方案 1 + 解决方案 2), 以确保微阵列区域与增强解决方案保持联系。稀释后, 应在大约30-45 天内使用 H2O2 。 2. 纳米微粒的制备: 按照 Bastús et al的描述, 准备 40 nm AuNPs。16简要地, 将1毫升水中25毫米 HAuCl4前驱体注入2.2 毫米柠檬酸钠 (149 毫升) 的沸腾溶液中。等到红葡萄酒的颜色被观察到。将纳米微粒的溶液作为种子生长步骤的种子。 在90摄氏度, 注入1毫升的60毫米柠檬酸钠后, 1 毫升25毫米 HAuCl4进入含有溶液的种子。30分钟后, 反应完成。重复种子生长步骤五次, 直到得到40纳米纳米粒子, 如 Bastús et al所述。16 测量纳米粒子最终溶液的紫外可见光吸收量, 以确定纳米粒子的大小。17或者, 透射电子显微照片 (TEM) 可以获得并用于确定纳米粒子的大小。 按照 Rivero et al的描述, 准备 90 nm AgNPs。18简要地, 将 dimethylaminoborane (DMAB) 添加到聚合 (丙烯酸、钠盐) (临机) 和 AgNO3的强力搅拌溶液中。解决方案的最终体积为50毫升, DMAB、临机局和 AgNO3的最终浓度分别为1.6 毫米、10毫米和3.33 毫米。注: 100 纳米 IONPs 改性羧基组和 50 nm SiNPs 改性羧基组购买。 Functionalize 使用 Puertas et描述的协议后的抗体 AuNPs。19简要地, 将1毫克的 COOH (5000 g·mol−1) 添加到 1.2×10-9 M AuNPs (10 光密度、OD) 的解决方案中。用4米氢氧化钠溶液将 pH 值调整为12。 在温和的搅拌条件下, 让溶液在室温下 (22 摄氏度) 孵化一夜。 通过将溶液离心 13800 x g 以15分钟的方式除去多余的 PEG。 用 500 ul 的去离子水并用重悬颗粒。 用5μmol n-(3-Dimethylaminopropyl)-n ‘-ethylcarbodiimide 盐酸盐 (AuNPs) 和7.5 μmol 的 n-hydroxysulfosuccinimide 钠盐 (磺-NHS) 在10毫米 MES 中孵化出 PEG 修饰的, 6 摄氏度为30分钟。 通过离心 13800 x g 的溶液, 以5分钟的方式去除磺和亚胺酰胺的过量。 并用重悬颗粒在500µL 10 毫米 MES pH 6 缓冲和添加 100g·mL -1 抗体。让溶液孵育2小时, 在37摄氏度。 去除抗体的过量通过离心溶液在 13800 x g 10 分钟两次和并用重悬颗粒在 500 ul 10 毫米磷酸磷酸钠 pH 值 7.5, 0.3 M NaCl 缓冲。让溶液孵育30分钟, 在37摄氏度。 去除不特异的绑定抗体通过离心溶液在 13800 x g 10 分钟两次, 并并用重悬在 500 ul 1% 牛血清白蛋白 (BSA) 在10毫米 MES pH 值6缓冲区的颗粒。在4摄氏度一夜之间孵化样品。 通过离心溶液在 13800 x g 10 分钟两次清洗 BSA 的过量, 并在 500 ul 10 毫米 MES pH 值6缓冲器中 resuspending 颗粒。 遵循步骤2.5.1 通过2.5.9 的修改5米 AgNPs, 0.5 毫克 IONPS 和0.5 毫克 SiNPs 与抗体, 调整的数量和磺-NHS 相应。 3. 垂直流纸的化验方法: 用机器人打印机将蛋白质 G 的梯度浓度沉积在硝化棉纸膜上, 制备微阵列。打印后, 让微阵列在室温下过夜 (摄氏22摄氏度)。 用过滤器内所附膜进行垂直流动试验。使用超注射器泵, 以 1 mL·min−1的速率, 以8米的 AuNPs 溶液进行 IgG 修饰。重复此步骤, 解决方案为 17 M IgG 修饰 AgNPs, 0.1 mg·mL−1 IgG 修饰 SiNPs 和 0.1 mg·mL−1 igg 修饰 IONPs。 让微阵列在室温下干燥 (约22°c) 30 分钟, 然后在平板扫描仪中扫描 4800 dpi 分辨率。将图像另存为24位彩色 TIFF 文件。 4. 参照商用玻璃的化验方法: 在室温下孵化两张120分钟的玻璃滑梯, 用于检测4种不同人体血清样品的过敏原成分。 用去离子水冲洗微阵列。 用荧光共轭抗人 ige 抗体在室温下孵化一张幻灯片 (~ 22°C) 30 分钟. 用抗人 IgE 抗体修饰 AuNPs 在室温下孵化第二张幻灯片。 用去离子水冲洗微阵列。 用激光扫描仪测定用荧光抗人 IgE 抗体孵化的微阵列的荧光强度。数字化的基因芯片, 与抗人 IgE 抗体修改 AuNPs 与一个桌面扫描仪的比色信号采集。 数字化后, 在室温下 (~ 22°C) 用增强溶液孵育微阵列5分钟。 用去离子水冲洗传感器, 使其在室温下干燥10分钟 (摄氏22摄氏度)。 数字化在 4800 dpi 的分辨率下, 用桌面扫描仪将微阵列用于色度信号采集。将图像另存为16位灰度 TIFF 文件。 5. 采用增强解决方案的微阵列孵化: 预混合相同数量的解决方案1和解决方案2或直接混合在传感器的表面上, 并确保芯片上感兴趣的领域涵盖了解决方案的混合物。 让传感器在室温下孵育5分钟以上的增强溶液, 可提高灵敏度和较高的噪声/信号比, 尤其是纸基微阵列。 在5秒内将微阵列浸入去离子水中, 将其洗净. 在室温下保持干燥。注意: 干燥步骤的时间取决于芯片的材料。对于基于纸张的微阵列, 干燥步骤需要大约30分钟。对于基于玻璃的微阵列, 干燥步骤需要大约5-10 分钟。 6. 成像分析: 用软件工具分析荧光强度。根据传感器制造商的使用说明 (DfU), 考虑所有相等或大于 0.3 Isac 标准化单元的结果。 使用软件工具分析色度强度。反转图像文件, 测量每个光斑的强度, 计算平均像素强度。使用三个点的值计算最终信号值作为三平均光斑像素强度的平均值。