تعزيز السريع نانوبروبي إشارة بتوليف نانوحبيبات الذهب في الموقع
Summary
ويرد في هذا العمل، وضع بروتوكول لتعزيز الإشارات بيوسينسينج على أساس نانوبروبي. ويستند البروتوكول الحد حمض تشلورووريك على السطح من القائمة نانوبروبيس التي تتكون من الذهب والفضة، والسليكا وأكسيد الحديد جسيمات نانوية.
Abstract
لتمكين استخدام نانوبروبيس مثل الذهب والفضة، والسليكا وأكسيد الحديد جسيمات نانوية كالكشف عن المواد الكاشفة في فحوصات بيواناليتيكال حساسية عالية وقراءات قياس الألوان مريحة. بيد أنه يلزم عادة كثافة عالية من جسيمات نانوية للكشف. البروتوكولات المتاحة تحسين المستندة إلى توليف أما جسيمات نانوية المحدودة للذهب والفضة أو تعتمد على دقة السيطرة الانزيمية والتحسين. نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعزيز قراءات قياس الألوان من الذهب والفضة، والسليكا وأكسيد الحديد نانوبروبيس. ولوحظ أن الإشارة اللونية يمكن أن تتحسن بما يصل إلى عامل 10000-fold. هو الأساس لمثل هذه الاستراتيجيات تعزيز إشارة الاختزال الكيميائي Au3 + للاتحاد الأفريقي0. وهناك العديد من التفاعلات الكيميائية التي تمكن من الحد من الاتحاد الأفريقي3 + للاتحاد الأفريقي0. في البروتوكول، ويتم استخدام المخازن المؤقتة لحسن وح2س2 ومن الممكن أن ترسب الاتحاد الأفريقي0 على السطح نانوبروبيس القائمة، على حساب تكوين جسيمات نانوية ذهبية جديدة لصالح. البروتوكول يتكون من الحضانة ميكرواري مع حل تتألف من حمض تشلورووريك وح2س2 في 2-(ن-morpholino) اثانيسولفونيك حامضي 6 المخزن المؤقت بعد الفحص الكشف على أساس نانوبروبي. يمكن تطبيق الحل تعزيز للورق وأجهزة الاستشعار المستندة إلى الزجاج. وعلاوة على ذلك، استخدامها في تحديدكم المتاحة تجارياً كما يتضح من تطبيق الأسلوب على ميكرواري حساسية تجارية. ويتطلب وضع إشارة أقل من 5 دقائق للحضانة مع تعزيز الحل ويمكن تقييمها قراءات بالعين المجردة أو بأجهزة اقتناء الصور المنخفضة مثل كاميرا رقمية أو ماسح ضوئي أعلى الجدول.
Introduction
وقد يسمح باستخدام المواد النانوية مثل الذهب جسيمات نانوية (أونبس) أو جسيمات نانوية أكسيد الحديد (إيونبس) التطبيقات في بيوسينسينج مع تحسين حساسية وبراعة. 1 تمكين عدد كبير الأساليب المتقدمة للزخرفة السطحية للجسيمات النانوية مع يغاندس المختلفة، فيما يتعلق بالاستفادة من سطحها عالية لنسبة الحجم، تصميم أجهزة الاستشعار مع تحسين حساسية. 2 مع ذلك، أداة بيوسينسينج فيعتمد على عدد نانوبروبيس اللازمة لتحقيق إشارة قابلة للاكتشاف. على سبيل المثال، في حالة 40 نانومتر أونبس، للحصول على إشارة من خلال التحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية، قرابة 90 × 106 نانوبروبيس مطلوب من أجل فعالية الكشف عن هدف الفائدة. 3 يمكن التحايل عليها هذا القيد الكثافة نانوبروبي عن طريق استخدام تضخيم الإشارات. يمكن أن تستند هذه الاستراتيجيات4 إلى تجميع إينتيربارتيكلي أو تجمع سكاني، حيث تزداد كثافة نانوبروبيس الأولية بتجميع مجموعة ثانية من نانوبروبيس عند الأول. 5 زيادة عدد جسيمات نانوية في موقع معين على سطح جهاز استشعار يسمح البصرية أو اقتناء إشارة تجاه الأشعة فوق البنفسجية. سيتم ربط حساسية المقايسة بيد أصلاً لاستهداف قدرة المجموعة الثانية من جسيمات نانوية نحو مجموعة أولية من نانوبروبيس. استراتيجيات أخرى تعتمد على تلطيخ نانوبروبيس أما الذهب والفضة. 6 , 7 وتلطيخ يتحقق عن طريق الحد أيونات الفضة على السطح من جسيمات نانوية، تمكين أحد البصرية أو كشف الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة. 8 هذه الأساليب تعزيز إشارة القائمة الذهب أو الفضة نانوبروبيس من بوتينتياتينج السطح الرنين مأكل مثل الطحين إشارة، لا اعتماداً على الأحداث تستهدف الثانوية كما هو الحال في أساليب التكتل إينتيربارتيكلي. ومع ذلك، أبلغ أساليب المصبوغة الفضة فقط مع استخدام نانوبروبيس الذهبية أو الفضية. 8 , 9
وفي عام 2005، زاياتس وآخرون. وأفادت 10 الحد أيونات الاتحاد الأفريقي على السطح نانوبروبيس الذهبية لزيادة إشارة الرنين السطحية مأكل مثل الطحين. من أجله بيروكسيد الهيدروجين في هذا العمل، وتعتمد على إنزيم الجلوكوز أوكسيديز الحفز وجنبا إلى جنب مع كلوريد سيتيلتريميثيلامونيوم يسمح بالحد حمض تشلورووريك.
في الآونة الأخيرة وانغ وآخرون. ذكرت طريقة تعزيز حيث يتم إنتاج الذهب طبقة على سطح نانوبروبيس القائمة. 11 هذه نانوبروبيس الموسع عرض نشاط الحفاز مثل البيروكسيديز ضد الركازة 3، 5، 5 ‘–تيتراميثيلبينزيديني (TMB) تمكين التصور من اللون الأزرق الساطع بالعين المجردة.
ستيفنز et al. وأفادت تنمية مقايسة على أساس أليسا plasmonic. 12 بعد الكشف عن مستضد البروستات محددة (PSA) من خلال استراتيجية أليسا تقليدية، جسم ثانوي المسمى بحدث كان المحتضنة مع استشعار بعدها الاستشعار كانت مغمورة في محلول يحتوي على بيروكسيد الهيدروجين و حمض تشلورووريك. وجود جسم تعديل كاتالاز الثانوي (نتيجة إيجابية) سيعزز استهلاك بيروكسيد الهيدروجين، تباطؤ بانخفاض حمض تشلورووريك والعائد شبه كروية مونوديسبيرسيد أونبس بلون أحمر. نظراً لغياب جسم تعديل كاتالاز (نتيجة سلبية) يسمح بتركيز فوق أكسيد الهيدروجين لتبقى سليمة، وبالتالي تشجيع الحد تشلورووريك السريع والعائد أونبس مع مورفولوجيس غير محددة مسؤولة عن لون أزرق/أرجواني . وأبدى تركيز فوق أكسيد الهيدروجين، يحددها نشاط الكاتلاز، إلى الارتباط بتركيز أكثر الفائدة. هي الحاجة إلى جسم ثانوي تعديل الكاتالاز ومراقبة ظروف النشاط الحفاز اثنين من العوامل التي تعوق الطابع العالمي لهذا الأسلوب. وعلاوة على ذلك، تشكيل مجموعات الذهب، مستقلة عن أونبس القائمة، قد يعرض القضايا الضوضاء الخلفية باستراتيجية التضخيم.
التقنيات المذكورة أعلاه، كما أيضا عدة أشخاص آخرين13،14،15، جعلت من الممكن لأجهزة استشعار العوامل البيولوجية على أساس نانوبروبي لتحقيق الحدود للكشف على قدم المساواة مع التقنيات التقليدية.
هنا، هو أظهر أسلوب رواية تعزيز الذهب، حيث يتم تضخيمه الإشارة من نانوبروبي الموجودة قد أو إدخال إشارة رنين سطحية مأكل مثل الطحين. بعد أن يجري الكشف عن باستخدام الذهب والفضة، والسليكا وأكسيد الحديد جسيمات نانوية، أجهزة الاستشعار مسموح لاحتضان مع حلاً خليط من بيروكسيد الهيدروجين، وحمض تشلورواوريك في 2-(ن-Morpholino) حمض اثانيسولفونيك (MES) الرقم الهيدروجيني 6 المخزن المؤقت. كانت الأمثل تركيزات المكونات الموجودة في الحل تعزيز لصالح ترسب الاتحاد الأفريقي0 على سطح نانوبروبيس القائمة. لكل درس أنواع نانوبروبي، أي. أونبس، أسفرت عن الفضة جسيمات نانوية (أجنبس)، والسليكا جسيمات نانوية (سينبس) وإيونبس، تشكيل طبقة غير محددة أو المعقم بعثرة الضوء مما أدى إلى إشارة مرئية يمكن كشفها أو زيادة. وتحققت زيادة إشارة مع معامل تضخيم 100-fold نانوبروبيس في ورقة والقائم على الزجاج [ميكروارس] وتستغرق العملية أقل من 5 دقائق للحصول على إشارة. ويمكن أن يتم الحصول على إشارة بالعين المجردة، مطيافية الأشعة فوق البنفسجية مقابل أو التصوير الأدوات المنخفضة مثل كاميرا رقمية أو ماسح ضوئي أعلى الجدول. وعلاوة على ذلك، وثبت أن هذا البروتوكول تعزيز يمكن تطبيقها سهولة في مقايسة تشخيصية الحساسية متوفرة تجارياً دون الحاجة إلى التحسين المحددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
حاليا، تقنيات تعزيز إشارة لفحوصات بالكشف على أساس نانوبروبي أما على أساس إنزيم12، تتطلب مجموعة ثانية من جسيمات نانوية للهدف نانوبروبيس الكشف عن21 أو، في حالة تلوين تقنيات، محدودة باستخدام أونبس أو أجنبس كالكشف عن تحقيقات. 22 هنا، هو وصف أسلوب بسيط وسريع وخال من إنزيم لتعزيز الإشارات من الاختبارات المستندة إلى الكشف عن نانوبروبي. بهذه الطريقة، كان من الممكن لتعزيز الإشارات اللونية المقدمة من 4 أنواع من نانوبروبيس: أونبس، أجنبس، إيونبس، وسينبس.
وكان معامل التضخيم المرصودة لكل مجموعة من نانوبروبيس من معززات، فيما عدا سينبس حيث القياس الكمي لعامل تعزيز لم يكن من الممكن الواجب لعدم وجود إشارات قبل تعزيز. هذا عامل تعزيز تشير إلى أن فعالية البروتوكول مماثلة عبر كافة أنواع نانوبروبيس. وعلاوة على ذلك، عندما نفذ البروتوكول تعزيز على دعم ورق حيث تمت طباعة سلسلة إضعاف من وقف أونبس الأسهم، لوحظ عامل تضخيم 10000-fold. السابقة لتعزيز، البقع مرئية مع أقل عدد من أونبس بحيث تم طبع حوالي 10000 جسيمات نانوية، بعد تعزيز البقع إيواء جسيمات نانوية أقل من 10 أصبحت مرئية. 20
وسمحت الشروط المحددة لتعزيز البروتوكول المعروضة هنا الاستفادة من الحد من الاتحاد الأفريقي3 + ل الاتحاد الأفريقي0 لتحسين إشارة، مع الحفاظ على ضجيج الخلفية إلى الحد أدنى. يمكن أن يؤديها في تعزيز حق بعد إجراء المقايسة فضلا على [ميكروارس] التي تم تخزينها لمدة تصل إلى عدة أشهر بعد المقايسة أنجز. تعزيز الحل يتكون من خليط 1:1 من الحل 1 و 2 الحل. يمكن سابقا مختلطة أو مختلطة مباشرة عند بيبيتيد على ميكرواري كل الحلول. الفرق بين قبل الخلط أو المزج مباشرة يؤثر فقط الحياة-الجرف لتعزيز الحل. عندما قبل مختلطة صلاحيتها من 5-7 أيام زيادة على 30-45 يوما إذا لم يكن مسبقاً مختلطة.
وقد أظهرت مزيدا من التحليل للنتائج أن الأسلوب تعزيز لا تتداخل مع التحليل الكمي بيوسينسور. وأبقى على علاقة خطية بين كثافة لاحظ وتركز أكثر (الجدول 1). وأظهرت البيانات التي تم الحصول عليها للعينات السريرية تتميز قبل 4 استخدام المناعة ميكرواري المكونات المسببة للحساسية القائمة على الزجاج، مع كشف fluorescence القياسية والكشف عن قياس الألوان، الفهرس أبجدي جيدة بين أساليب الكشف عن اثنين. مقارنة كثافة fluorescence يعني (MFI) والكثافة اللونية يعني (MCI)، متوسط ص2 = 0.79 +/-0.08 تم الحصول عليها عندما تكون البيانات 10-تسجيل على كلا محاور. وأظهرت هذه التجربة أن الأسلوب تعزيز يمكن تطبيقها على مجموعة تجارية إذا كان يستخدم في نانوبروبيس للكشف أو يمكن تكييفها للكشف على أساس نانوبروبي.
تعزيز فعالية أسلوب يعتمد على جانبين من جوانب حاسمة. من المهم أن أؤكد أنه خليط الحل 1 والحل 2 متجانسة. دون خليط متجانس، ستكون أجهزة الاستشعار على اتصال بكسور لتعزيز الحل حيث حل 1 أو 2 السائد بالنسبة للآخر. أن يقلل من الكفاءة للحد من الاتحاد الأفريقي3 + للاتحاد الأفريقي0، وبالتالي الأضرار بكفاءة تعزيز. من المهم أيضا أن المنطقة بأكملها لمصلحة ميكرواري على اتصال بتعزيز الحل خلال فترة الحضانة.
لتحقيق أولتراسينسيتيفي تعزيز إشارة، سيكون فترة حضانة أطول (حوالي 5 دقائق) مع تعزيز الحل المطلوب. لتجنب وضع الضوضاء الخلفية التي يمكن أن تتداخل مع الحصول على إشارة، ينبغي أن يكون السطح ميكرواري المحظورة سابقا (مثل جيش صرب البوسنة، شماعة) لمنع ترسب غير محدد السريع للاتحاد الأفريقي0 وما يترتب عليها من تشكيل من الذهب طبقة.
حد لتعزيز الأسلوب هو فعالية المتأصلة المقايسة. الفحص يتطلب وجود عناصر سلبية وإيجابية بما يكفل التقيد بتعزيز إشارة يمكن أن يعزى إلى نتائج إيجابية حقيقية. إذا كان هناك تفاعل غير محددة نانوبروبيس مع الهدف، اكتسبت إشارات بعد تعزيز لن يكون صالحاً.
تعزيز تقنيات أخرى استناداً إلى التجميع نانوحبيبات أما أو المصبوغة لجسيمات نانوية مع مواد التي تتيح الحصول على إشارة محسنة. عن طريق تعزيز جمع عدد من جسيمات نانوية في موقع الكشف، الحصول على إشارة يكون ممكناً أما بصريا أو قياسات الأشعة فوق البنفسجية-Vis. 5 تقنيات تعزيز هذه الإشارات تعتمد على نظام الكشف عن مرحلتين، الأولى الكشف عن أكثر من الفائدة، وخطوة ثانية حيث مطلوب المراسل لربط بناء الكشف الأولى. تفتقر هذه الاستراتيجيات العالمية نظراً لاشتراط محدد تعزيز البروتوكول الأمثل لكل نوع من التحليل.
تقنيات تعزيز المصبوغة، مثل الفضة تلطيخ، كثير مثل البروتوكول المعروضة هنا، تتيح تعزيز بنيات الكشف عن إشارة مباشرة. ومع ذلك، خلافا للبروتوكول الذي هو موضح هنا، تلطيخ الفضة فقط قد ثبت ليتم تطبيقها على أونبس أو أجنبس. 6 , 7 , 8 , 9
انطباق هذا الأسلوب يمكن أن المحتمل أن تمتد أي الإنزيم الذي يستخدم أونبس أو أجنبس أو إيونبس أو سينبس كعوامل الكشف. يجري مزيد من العمل لدراسة تطبيق الأسلوب في أجهزة الاستشعار التي تتكون من مواد أخرى.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل من “مجلس البحوث الأوروبية” ضمن “البرنامج الإطاري السابع” للاتحاد الأوروبي (FP/2007-2013)/منسق الإغاثة الطارئة منحة الاتفاق رقم 615458، المجلس السويدي للبحوث والتميز برونوفا مركز للتكنولوجيا البروتين (فينوفا-السويدية العرفان هو الوكالة الحكومية لنظم الابتكار).
Materials
| Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
| Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
| 100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
| 50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
| COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
| IgG antibody | Abcam | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
| Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
| Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
| Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
| Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
| Filter holder | Merck | XX3001200 | |
| PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
| Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
| Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
| Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
| Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
| Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
| Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |
Referências
- Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1 (2014).
- Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48 (2014).
- Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
- Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
- Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
- Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
- Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
- Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
- Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
- Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
- Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
- de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
- Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
- Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
- Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
- Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101 (2013).
- Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
- Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837 (2017).
- Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
- Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).
