Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra
Summary
Este protocolo describe un método para la photoconversion de Kaede proteína fluorescente en células endocárdicos de la vida del embrión de pez cebra que permite el seguimiento de células del Canal auriculoventricular durante canal atrio-ventricular y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón .
Abstract
Durante la embriogénesis, las células se someten a cambios dinámicos en el comportamiento de la célula, y descifrar la lógica celular detrás de estos cambios es una meta fundamental en el campo de la biología del desarrollo. El descubrimiento y desarrollo de proteínas de photoconvertible han ayudado grandemente nuestra comprensión de estos cambios dinámicos al proporcionar un método para resaltar ópticamente las células y tejidos. Sin embargo, mientras que photoconversion, Time-lapse microscopía y análisis posteriores han demostrado para ser muy exitosa en descubrir dinámica celular en órganos como el cerebro o el ojo, este enfoque generalmente no se utiliza en pleno desarrollo debido a desafíos planteados por el rápido movimiento del corazón durante el ciclo cardíaco. Este protocolo consta de dos partes. La primera parte describe un método para photoconverting y posteriormente seguimiento de células del Canal auriculoventricular (EdCs) en pez cebra canal auriculoventricular (CAV) y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón. El método consiste en detener temporalmente el corazón con una droga en orden para photoconversion exacto lugar. Corazones están autorizados a reanudar la paliza sobre retiro de la droga y el desarrollo embrionario continúa normalmente hasta que el corazón está parado otra vez para la proyección de imagen de alta resolución de photoconverted EdCs en un punto del tiempo de desarrollo más adelante. La segunda parte del protocolo describe un método de análisis de imagen para cuantificar la longitud de una región photoconverted o no photoconverted en el AVC en embriones jóvenes mediante la asignación de la señal fluorescente de la estructura tridimensional en un mapa bidimensional . Juntas, las dos partes del protocolo permite examinar el origen y el comportamiento de las células que conforman el pez cebra AVC y válvula auriculoventricular del corazón y potencialmente puede aplicarse para el estudio de mutantes, morphants o embriones que han sido tratados con reactivos que interrumpen el desarrollo AVC o válvula.
Introduction
El pez cebra es actualmente uno de los más importantes modelos vertebrados para estudiar los procesos celulares y de desarrollo en vivo. Esto es en gran parte debido a la transparencia óptica de pez cebra y receptividad a la genética, que es un potente modelo para la aplicación de técnicas ópticas genéticamente codificado photoresponsive proteína tecnologías1. Específicas para el estudio del desarrollo del corazón, pez cebra recibe suficiente oxígeno por difusión que incluso mutantes sin latidos del corazón pueden sobrevivir a través de la primera semana de desarrollo, que permitan el análisis de los efectos de los genes del desarrollo y perturbado flujo de sangre en la morfogénesis del corazón no es posible en la mayoría vertebrados2.
El tubo de corazón de pez cebra está formado por 24 horas post fecundación (hpf). Poco después de su formación, el tubo del corazón comienza batiendo activamente. Por 36 hpf, una clara constricción separa la aurícula del ventrículo. Esta región de constricción se llama el canal auriculoventricular (CAV) y las células en esta región el cambio de una morfología escamosa a una morfología cuboidal3. Pez cebra válvula auriculoventricular morfogénesis se inicia alrededor de 48 h post fertilización. 5 días post fertilización, dos valvas se extienden al AVC y prevenir el flujo retrógrado de sangre desde el ventrículo a la aurícula durante el ciclo cardíaco4. Seguimiento de las células durante la formación de AVC y la válvula es un reto como el latido rápido del corazón hace que sea difícil seguir las células vía microscopia Time-lapse tradicional5,6. Este protocolo, adaptado de Steed et al., 20167, describe un método que utiliza la Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 pez cebra transgénica línea, en la que la proteína de photoconvertible Kaede se expresa en células endoteliales, incluyendo el endocardio. La droga 2, 3-butanedione-2-monoxima (BDM) se utiliza para detener temporalmente el corazón latiendo, lo que permite photoconversion exacta de EdCs entre 36 y 55 hpf y proyección de imagen de alta resolución de photoconverted EdCs en momentos específicos de desarrollo. Se ha demostrado previamente que EdCs photoconverted utilizando este método puede seguir siendo distinguible de sus vecinos inconversos durante cinco días o más después del tiempo de photoconversion7. Este protocolo también detalla un método utilizado para el análisis de la imagen de photoconverted EdCs en embriones menores de 48 hpf, que se ha utilizado con éxito para seguir movimientos de tejido durante el desarrollo de AVC (Boselli et al., en prensa)9. Esperamos que los lectores encontrarán este protocolo útil para el estudio de AVC y válvula de desarrollo de embriones normales y mutantes, morphants o embriones tratados con drogas. Para un protocolo más general sobre rastreo de celulares usando photoconvertible proteínas durante el desarrollo del pez cebra, vea por favor el artículo por Lombardo et al., 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tiempo de photoconversion: Kaede aunque sigue siendo brillantemente expresada en EdCs en 96 hpf, cabe señalar que a medida que el embrión crece, la luz laser difunde más antes de que llegue el AVC, dificultando el photoconversion confinado de Kaede. En embrionario etapas después de 55 años hpf, la dilatación del ventrículo y la aurícula también significa que el haz de láser violeta utilizado para photoconversion no puede llegar a las células de AVC sin pasar a través de la aurícula o ventrículo. Es…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli y Basile Gurchenkov para ayudar a diseñar y hacer el molde que se describe en este protocolo. Este trabajo fue financiado por la ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), el programa EMBO joven investigador, FRM (DEQ20140329553), la Comunidad Europea, ERC CoG N ° 682938 Evalve y por el subsidio ANR-10-LABX-0030-INRT, a cargo de un fondo del Estado francés la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir etiquetado ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
Referências
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