После эндокарда ткани движения через ячейки Photoconversion в Zebrafish эмбриона
Summary
Этот протокол описывает метод для photoconversion Каэдэ флуоресцентный белок в эндокарда клетки живых zebrafish эмбриона, который позволяет отслеживать эндокарда клеток во время предсердно-канал и предсердно сердца клапан развития .
Abstract
Во время эмбриогенеза клетки претерпевают динамические изменения в поведение клеток, и расшифровка сотовой логику этих изменений является основополагающей целью в области биологии развития. Открытие и разработка photoconvertible белков значительно помог наше понимание этих динамических изменений, предоставляя метод оптически highlight клеток и тканей. Однако хотя photoconversion, покадровой микроскопия и анализ изображений последующих оказались весьма успешными в раскрытии сотовой динамике в органы как мозг или глаз, этот подход обычно не используется в развивающихся сердце проблемы, связанные с быстрым движением сердца во время сердечного цикла. Этот протокол состоит из двух частей. Первая часть описывает метод для photoconverting и впоследствии отслеживания эндокарда клетки (ЭЭС) во время данио рерио предсердно-канал (AVC) и предсердно сердца клапан развития. Метод предполагает височно остановки сердца с наркотиками в целях точного photoconversion занять место. Сердца разрешается возобновить избиение после удаления препарата и эмбрионального развития обычно продолжается до тех пор, пока сердце снова остановился за разрешением изображений photoconverted ЭЭС в точке позднее развития время. Второй частью протокола описывает метод анализа изображений для количественного определения длины photoconverted или не photoconverted региона в АВК в молодых эмбрионов путем сопоставления флуоресцентного сигнала от трехмерной структуры на двумерной карте . Вместе эти две части протокола позволяет изучить происхождение и поведение клеток, которые составляют данио рерио AVC и предсердно сердечного клапана и потенциально могут быть применены для изучения мутантов, morphants или эмбрионов, которые были обработаны с Реагенты, которые нарушают AVC и/или клапан развития.
Introduction
Данио рерио в настоящее время является одним из самых важных позвоночных моделей для изучения клеточных и развития процессов в естественных условиях. Это во многом объясняется данио рерио оптической прозрачности и ограниченой к генетике, что делает его мощным модель для применения оптических методов, связанных с генетически закодированный photoresponsive белка технологий1. Специфичные для изучения развития сердца, данио рерио получать достаточно кислорода через распространение таким образом, что даже мутантов без сердцебиение может выжить через первую неделю развития, позволяя анализы последствий развития генов и возмущенных поток крови на сердце морфогенеза невозможно в большинстве позвоночных животных2.
Данио рерио трубка сердца формируется 24 часа пост оплодотворение (hpf). Вскоре после его формирования трубка сердце начинает активно биться. От 36 hpf, ясно сужение отделяет атриум из желудочка. Этот регион сужение называют предсердно канал (AVC) и ячейки в этой области изменения от плоскоклеточный морфология шестигранника морфология3. Данио рерио предсердно клапан морфогенеза начинается около 48 h пост оплодотворения. 5 дней пост оплодотворение, две листовки клапан расширения в АВК и предотвращения обратного потока крови из желудочков в зимнем саду во время сердечного цикла4. Отслеживание клетки во время формирования AVC и клапан является сложной задачей, как быстрое биение сердца делает его трудно следовать клетки через традиционными покадровой микроскопии5,6. Этот протокол, адаптированный Стид et al., 20167, описывает метод, использующий Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 данио рерио трансгенные линии, в котором белка photoconvertible Каэдэ выражается в эндотелиальные клетки, включая эндокарда. Наркотиков 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) используется для временной остановки сердца биться, позволяя точной photoconversion ЭЭС между 36 и 55 hpf и с высоким разрешением изображений photoconverted ЭЭС в определенное время развития точках. Ранее было показано, что photoconverted ЭЭС с помощью этого метода может оставаться отличимые от их нереализованный соседей или более пяти дней после времени photoconversion7. Этот протокол также подробно метод, используемый для анализа изображений photoconverted ЭЭС в эмбрионов, моложе, чем 48 hpf, которая успешно использовалась следовать ткани движений во время развития AVC (Боселли et al., в печати)9. Мы надеемся на то, что читатели найдут этот протокол полезным для изучения AVC и клапан развития в нормальных эмбрионов, а в мутантов, morphants или наркотики лечение эмбрионов. Для более общего протокола, касающегося отслеживания ячейки с помощью photoconvertible белков во время разработки данио рерио пожалуйста, просмотрите статью, Ломбардо et al., 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сроки photoconversion: Хотя Каэдэ остается ярко выраженный в ЭЭС, даже на 96 hpf, следует отметить, что по мере развития эмбриона, лазерный свет рассеивает больше прежде чем он достигнет AVC, затрудняя замкнутых photoconversion Каэдэ. В эмбриональных стадий позднее 55 hpf, воздухоплавание предсердия и же…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Энн-Laure Duchemin, Дениз Duchemin, Натали Faggianelli и Basile ГУРЧЕНКОВ за помощь дизайн и сделать плесень, указанных в настоящем Протоколе. Эта работа была поддержана FRM (DEQ20140329553), НРУ (АНР-15-CE13-0015-01, АНР-12-ISV2-0001-01), программа следователя ЭМБО молодых, Европейское сообщество, КЧП CoG N ° 682938 компьютерные и Грантом АНР-10-LABX-0030-INRT, французский государственный фонд управляется Agence Nationale de la Recherche под рамки программы Investissements будущее меткой НРА-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
Referências
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. . Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
