Summary

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Published: April 20, 2018
doi:

Summary

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

Abstract

치경 대 식 세포는 태아 근원의 말기 분화, 폐 상주 대 식 세포. 치경 대 식 세포는 그들의 긴 수명 및 폐 지역화 감염 및 염증 응답 뿐만 아니라 폐 개발 및 기능, 그들의 중요 한 역할에서 고유. 날짜 하려면, 식별, 격리, 및 인간과 쥐에서 치경 대 식 세포의 취급에 대 한 통합된 방법 존재 합니다. 이러한 메서드는 다양 한 실험 설정에서 이러한 중요 한 타고 난 면역 세포에 대 한 연구에 대 한 필요 하다. 쉽게 어떤 연구소에 의해 채택 될 수 있습니다, 여기에, 설명 하는 방법을 bronchoalveolar 게 액체 또는 폐 조직에서 치경 대 식 세포를 수확 하 고 그들 에 시험관을 유지 하는 간단한 접근 방법입니다. 치경 대 식 세포는 폐 포에 부착 세포로 주로 발생 하기 때문에이 방법의 초점은 수확 및 식별 하기 전에 그들을 dislodging에 있습니다. 폐는 매우 vascularized 기관 그리고 골수성과 림프 근원의 다양 한 셀 형식 서식, 상호 작용, 폐 microenvironment에 의해 좌우 된다. 여기 설명 된 표면 마커 집합을 사용 하 여 연구원 수를 쉽고 명확 하 게 다른 백혈구에서 치경 대 식 세포를 구별 고 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들을 정화. 여기 개발 문화 메서드 두 인간을 지원 하 고 치경 대 식 세포에 체 외 성장에 대 한 마우스 세포질이 고 분자 연구와 호환 됩니다.

Introduction

폐 microenvironment 정교한 공기 도관, 맥 관 구조는 고유 하 게 복잡 한 생태계 이다. 흡입된 공기 혈액 공기 가스 교환 발생 하는 위치는 폐 포에 도달 하기 전에 기관 그리고 기관지 및 bronchioles의 수많은 분 지를 통해 여행. 분위기와 직접 상호 작용을 인해 호흡기 표면 공 수 입자와 오염 물질의 잠재적으로 유해한 영향 으로부터 보호를 요구 한다. 다양 한 물리, 화학, 및 면역학 장벽 폐를 보호합니다. 특히, 호흡기 표면에 phagocytes의 배포는 중요 한 첫 번째-라인 방어 시스템을 제공합니다. 치경 세포 (AMs)는 한 가지 유형의 폐 상주 식 세포, 그리고 그들은 폐 대 식 세포 수영장의 대부분을. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, AMs 주로 치경 루멘에 지역화 하 고 지속적으로 주변 분위기를 샘플 하 고 치경 상피1와 통신 하는 무 셀으로 발생 합니다. 정상 상태 폐에서 치조 공간에서 식 세포의 95%는 AMs2, 염증, 감염, 또는 오염 물질에 만성 노출의 구성을 변경할 수 있습니다.

AMs 폐에 로컬 될 수 있는 함수 및/또는 조직의 중요성의 광범위에 참가 한다. 예를 들어 AMs는 개발 및 폐;의 최적의 기능에 필수적 면역 감시; 그리고 세포 파편, 병원 균와 흡입된 입자3,,45,,67의. AMs의 타겟된 고갈 호흡기 바이러스 및 박테리아4,8의 손상으로 알려져 있다. 식 세포와 폐 항상성의 첫 줄 수비수로 서 자신의 역할, 외 AMs 알려져 있습니다 T 도출에 세포를 항 원 제시 세포 면역9, 작동 potentiating intranasal 백신10 의 효능과 폐 이식11,12후 폐 제한 면역에 영향을 미치는. 오전 기능 결핍 폐 치조 proteinosis (PAP), 유전자 변이, 악성 종양 또는 감염 폐 계면 활성 제13,14의 손상 발생 조건에 연결 되었습니다. AMs의 이식 PAP 15,16의 처리를 위한 치료 방법으로 탐험 되 고 지금입니다.

AMs는 embryogenesis 동안 발생 하 고 인생을 통해 폐 순환 백혈구2,17로 대체 되 고 없이 유지 알려져 있습니다. 오전 매출의 다양 한 수준의 인플루엔자 바이러스4, myeloablative 조사18도에 노출에 의해 감염을 포함 하 여 특정 임상 상황에 보고 되었습니다 비록, 오전 회전율 homeostatic 폐에서 감지, 19, 그리고 나이20. AMs는 낮은 확산17,21를 통해 자기 갱신으로 하지만 일부 최근 연구 monocytes 혈관 내 폐 세포22,23 아래에서 인구를 야기할 수 있는 주장 하지만 이러한 새로 변환 된 폐 세포의 기능 실험 조건, 폐 질환에 정의 하 아직 있다. 또한, 폐 염증 신호 및 immunoregulatory 기계 사이 균형을 유지 하는 시도 잠재적으로 흥미로운 영역입니다 오전 활성화의 맥락에서 자극의 임계값을 이해.

면역 규칙의 손실 생리 또는 pathologic 변경 다양 한 임상 설정 (예: 호흡기 감염, 염증 성 폐 질환과 거리 폐 질환)에서 평가에 중요 하다. 그럼에도 불구 하 고, AMs는 지표 또는 폐 건강11,24의 심지어 결정 요인으로 점점 인식 된다. 현재, 수확, 특성화, 또는 인간 및 전 임상 murine 모델에서 유지 AMs 사용할 수 없는 통합된 프로토콜 있습니다. 오전 선구자 및 고기, 합의의 부족 및 상세한 방법론의 부재 폐 건강 및 질병에 오전의 해독 역할에서 주요 장애물이 있었다. 다음 프로토콜 최종 식별, 격리 및 생체 외에서 문화 전략을 크게 오전 동작의 이해를 전진 하 고 오전 대상으로 진단 및 치료 연구를 용이 하 게 제공 합니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 세인트 조셉의 병원 및 의료 센터에서 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다. 1. 절연 Murine Bronchoalveolar 게 (BAL) 액체에서 AMs의 케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는…

Representative Results

흐름 cytometric 접근 마우스 AMs를 식별 하는 그림 1에 표시 됩니다. 이 표면 마커 다른 폐 상주 또는 폐에 침투 식 세포에서 AMs를 구별 하는 데 필요한 최소한의 분석을 포함 한다. 차동 분석은 긍정적으로 중간 세포, 수지상 세포, 호 중구, monocytes, 및 폐에서 발생 하는 monocyte 파생 된 폐 세포에서 AMs를 식별 해야 합니다. 표면 마커 다음 구성표 쉽게 구별…

Discussion

AMs는 출생 시 시작 및26의 전체 수명 동안 지속 폐를 채우는 긴-생활 폐 상주 세포. 폐 생리학7 과 병리학12 및 폐 면역24 의 그들의 잠재력에서 그들의 역할을 인정 받고 있다. AMs 폐11,27 에 있는 장기 존재와 그들이 활성화 및 면역 반응11,24

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

원고 편집 도움에 감사 클레어 Prendergast 하 고. DKN 지원 연구 러닝 재단에서 (#2095) 부여 및 TM는 건강의 국가 학회 (R01HL056643 및 R01HL092514)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. DKN는 방법을 개발 하 고 연구를 설계 하 고, 쓴 원고; OM 지원 동물 연구와 임상 샘플 조달; SB 지원 흐름 cytometric 분석 및 세포 분류; TM 연구를 감독 하 고 원고를 검토.

Materials

Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

Referências

  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  3. Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
  4. Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
  5. MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
  6. Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
  7. Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
  8. Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
  9. Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
  10. Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
  11. Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
  12. Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
  13. Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
  14. Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
  15. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
  16. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  17. Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
  18. Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
  19. Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
  20. Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  21. Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
  22. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
  23. Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
  24. Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
  25. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
  26. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  27. Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
  28. Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).

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Citar este artigo
Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

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