إعداد موريني الغدة اللعابية اللهاة تستقيم مجهرية إينترافيتال
Summary
يصف لنا وضع بروتوكول لفضح جراحيا واستقرار الغدة اللعابية اللهاة مورين للتصوير إينترافيتال باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال منتصبة. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة إلى أخرى إفرازات الغدد للرأس ومنطقة الرقبة من الفئران والقوارض الصغيرة الأخرى.
Abstract
الغدة اللعابية اللهاة (SMG) هي واحدة من الغدد اللعابية الرئيسية الثلاثة، وهي تهم للعديد من المجالات المختلفة للبحوث البيولوجية، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا والأورام، وطب الأسنان، وعلم المناعة. إس أم جي إفرازات غدة تتألف من الخلايا الظهارية الافرازية، myofibroblasts، خلايا بطانية، والأعصاب، والمصفوفة خارج الخلية. سابقا قد تم تصويرها العمليات الحيوية الخلوية في الفئران والفأر SMG، ومعظمها باستخدام مقلوب مجهر فوتون متعدد النظم. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا مباشرة لإعداد العمليات الجراحية واستقرار SMG مورين في الفئران تخديره للتصوير في فيفو مع نظم تستقيم فوتون متعدد المجهر. نحن تقديم مجموعات تمثيلية إينترافيتال الصورة الذاتية ونقل الخلايا الفلورسنت، بما في ذلك العلامات من الأوعية الدموية أو القنوات اللعابية والجيل الثاني متناسق لتصور الكولاجين فيبريلار أدوبتيفيلي. وباختصار، لدينا البروتوكول يسمح لإعداد العمليات الجراحية الغدد اللعابية الماوس في الفحص المجهري تستقيم النظم التي تستخدم عادة لتصوير إينترافيتال في مجال علم المناعة.
Introduction
ويفرز اللعاب بواسطة إفرازات الغدد لتليين الطعام، وحماية السطوح المخاطية المسالك عن طريق الفم، وتسليم إنزيمات الجهاز الهضمي، وكذلك المواد المضادة للميكروبات1،2. بالإضافة إلى ثانوية الغدد اللعابية ويتخلل في سوبموكوسا عن طريق الفم، هناك ثلاث مجموعات ثنائية الغدد الرئيسية المحددة النكفية، تحت اللسان، واللهاة، وفقا لما الموقع1،2. على شكل هرم الخلايا الظهارية، نظمت في الأكياس على شكل قارورة (أسيني) أو ديميلونيس التي هي محاط بغشاء الطابق السفلي، وخلايا myoepithelial تفرز مكونات اللعاب1المصلي والأغشية المخاطية. المساحة لومينال الضيقة للمصارف أسيني في مجاري المقحم، التي توحد في مجاري striated حتى أنهم أخيرا الانضمام إلى مجرى هواء مطرح واحد1. القناة مطرح الرئيسية من إس أم جي يسمى مجرى الهواء في وارتون (WD) ويفتح في3،كارونكلي تحت اللسان4. ولذلك يمثل حجرة طلائي SMG بنية عالية أربوريزيد مع نقاط النهاية الطرفية المتعددة، تشبه حزمة من العنب1،،من56. إينتيرستيتيوم SMG يتكون من الأوعية الدموية واللمفاوية جزءا لا يتجزأ من النسيج الضام7 تحتوي على أعصاب الجهاز السمبتاوي8 و5من المصفوفة خارج الخلية. تحتوي أيضا على الغدد اللعابية القوارض والإنسان العادي تي الخلايا والضامة، والخلايا الجذعية9، فضلا عن خلايا البلازما التي تفرز الغلوبولين المناعي (IgA) في اللعاب9،10. بسبب وظائفها المتعددة الأوجه في الصحة والمرض، إس أم جي موضع اهتمام للعديد من مجالات البحوث البيولوجية، بما في ذلك طب الأسنان4وعلم المناعة11والأورام12، وعلم وظائف الأعضاء8وبيولوجيا الخلية 3.
تصوير من التفاعلات والعمليات الحيوية الخلوية أداة قوية في البحوث البيولوجية13،14. تطوير الأنسجة العميقة التصوير والابتكارات إينميكروسكوبيس استناداً الضوئية اللاخطية (نلو)، التي تعتمد على نثر أو امتصاص الفوتونات متعددة بواسطة العينة، سمح لمباشرة دراسة العمليات الخلوية في الأنسجة المعقدة13 ،15. امتصاص الفوتونات متعددة ينطوي على تسليم الطاقة الإجمالية الإثارة بالفوتونات طاقة منخفضة، أي حدود fluorophore الإثارة إلى المستوى البؤري ويسمح بالتالي أعمق اختراق الأنسجة مع انخفاض د والضوضاء من خارج التركيز الإثارة13،15. هذا المبدأ يعمل قبل يومين-فوتون مجهرية (02:00 م)، ويسمح بتصوير العينات الفلورسنت في أعماق تصل إلى 1 مم15،16. بينما المتاحة تجارياً 02:00 م أصبحت الأجهزة سهلة الاستخدام ويمكن الاعتماد عليها، هو التحدي الرئيسي لتصوير إينترافيتال فضح واستقرار الجهاز المستهدف من الفئران تخديره، خاصة بالنسبة لتصوير سلاسل الزمنية الفاصل بعناية. عدة طرق لتصحيح الانحراف الرقمية بعد قد تم الحصول على البيانات المنشورة17،18 وقمنا مؤخرا بتطوير “فيفوفولوو”، نظام تصحيح الآلي، الذي يصد الانجراف أنسجة بطيئة في الوقت الحقيقي باستخدام 19من مرحلة المحوسبة. ومع ذلك، أنها لا تزال حرجة للتصوير للتقليل من الأنسجة الحركة، لا سيما الحركات السريعة الناجمة عن التنفس أو ضربات القلب19عالية الجودة. وقد نشرت إجراءات إعداد وتحقيق الاستقرار لأجهزة متعددة، بما في ذلك الحبل الشوكي20و الكبد21والجلد22،23من الرئة والعقدة الليمفاوية24. وعلاوة على ذلك، تم المتقدمة3،25 نماذج لتصوير الغدة اللعابية الفئران ومزيد من الصقل لتصوير عالية الدقة إينترافيتال من الفاري SMG لتلائم مجهر مقلوب إعداد26، 27 , 28.
هنا، نحن نقدم بروتوكول عملي وقابلة للتكيف لتصوير إينترافيتال من SMG مورين استخدام تستقيم مجهرية غير الخطية، التي تستخدم عادة لتصوير إينترافيتال في مجال علم المناعة. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتعديل مرحلة التثبيت العاملين على نطاق واسع تستخدم للتحضير العقدة الليمفاوية المابضيه.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويوفر هذا البروتوكول نهجاً مباشرا للتصوير في فيفو مورين الغدد اللعابية تحت اللسان واللهاة باستخدام تستقيم مجهرية غير الخطية التي غالباً ما تستخدم في مجال علم المناعة. الأسلوب يمكن تكييفها لتصوير الغدد إفرازات أخرى في منطقة الرأس والرقبة. على سبيل المثال، قد يقوم لدينا مختبر تصوير ا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية (الجبهة الوطنية الصومالية) المشروع منحة 31003A_135649 و 31003A_153457 و 31003A_172994 (إلى JVS) وزمالة ليوبولدينا لبدس 2011-16 (للبكالوريوس). هذا العمل قد استفادت من الأجهزة البصرية “الفحص المجهري التصوير مركز” (هيئة التصنيع العسكري) بجامعة برن.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
Referências
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
- Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
- Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
- Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
- Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
- Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
- Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
- Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
- Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
- Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
- Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
- Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
- Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
- Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton’s duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
- Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
- McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
- Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).
- Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
- Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
- Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
- Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
- Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
- Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
- Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).
